【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞扩增的，特别涉及一种nk细胞高效扩增方法。
技术介绍
1、自然杀伤细胞(natural killer cell,nk细胞)来源于骨髓淋巴样干细胞，其分化、发育依赖于骨髓及胸腺微环境，主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结。nk细胞不同于t、b细胞，是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细。
2、由于nk细胞能够识别和裂解肿瘤细胞，以nk细胞为基础的肿瘤免疫治疗领域受到广泛关注。nk细胞的特点是它们具有通过不同机制杀死肿瘤细胞的潜力，而无需事先致敏，因此已成为癌症免疫治疗中的重要工具。但是其在外周血中的数量仅占淋巴细胞总量的5％左右，如何实现nk细胞体外扩增培养从而应用于治疗是关键的技术问题。
3、现有的nk细胞体外扩增手段主要包括在培养基中添加动物血清、细胞因子或与其它细胞共同培养来刺激nk细胞的生长。但是动物血清成分较复杂，易给细胞培养带来不安全因素；细胞因子的添加不当容易引起nk细胞激活受体和抑制受体表达变化；同时，异体的细胞也往往存在医学上的不安全性和伦理问题。因此，有必要开发一种高效、安全的nk细胞体外扩增方法从而为nk细胞的临床治疗应用提供有力的技术保障。因此，需要有一种能够提高扩增数量和纯度的nk细胞制备方法。
技术实现思路
1、针对现有技术所存在的技术问题，本专利技术提供了一种nk细胞高效扩增方法。该方法是依托于nk细胞高效扩增培养基而实现高效率扩增的目的，所述培养基是利用细胞因子组合与nk细胞促增
2、本专利技术的目的之一在于提供了一种nk细胞高效扩增培养基，其特征在于，所述培养基包括如下组分：dmem基础培养基、5-15ng/ml scf、5-15ng/ml il-3、5-15ng/ml g-csf、5-15ng/ml ifn-γ、20-50ng/ml nk细胞促增殖肽。
3、优选地，所述nk细胞高效扩增培养基包括如下组分：dmem基础培养基、5ng/mlscf、5ng/ml il-3、5ng/ml g-csf、5ng/ml ifn-γ、20ng/ml nk细胞促增殖肽。
4、优选地，所述nk细胞高效扩增培养基包括如下组分：dmem基础培养基、10ng/mlscf、10ng/ml il-3、10ng/ml g-csf、10ng/ml ifn-γ、30ng/ml nk细胞促增殖肽。
5、优选地，所述nk细胞高效扩增培养基包括如下组分：dmem基础培养基、15ng/mlscf、15ng/ml il-3、15ng/ml g-csf、15ng/ml ifn-γ、50ng/ml nk细胞促增殖肽。
6、优选地，所述nk细胞促增殖肽的氨基酸序列为
7、fcsgkiganvwkdnprgekwaglgphvrkrrpgqshcnrngcqnwrh iap(seq id no.1)。
8、本专利技术的目的之一在于提供了一种nk细胞高效扩增方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
9、1)nk细胞分离；
10、2)采用所述的nk细胞高效扩增培养基培养步骤1)中的nk细胞。
11、优选地，步骤1)是采用nk细胞分离液分选nk细胞；
12、进一步优选地，步骤1)的详细步骤包括：抽取新鲜健康成人外周血15ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离得到外周血单个核细胞，用macs缓冲液重悬细胞；依次加入nkcell biotin-antibody cocktail和nk cell microbead cocktail作细胞阳性分选，收集富含nk细胞的细胞悬液，用流式细胞术检测cd3-cd56+cd16+nk细胞纯度；
13、优选地，步骤2)是采用摇瓶培养收集nk细胞；
14、进一步优选地，步骤2)的详细步骤包括采用所述的nk细胞高效扩增培养基对步骤1)中的cd3-cd56+cd16+nk细胞重悬制成细胞密度为1×105/ml的细胞悬浮液，接种于培养瓶中，在37℃、5％co2条件下培养，每间隔2天进行半量换液，连续培养1周后，收集nk细胞。
15、本专利技术的优点如下：本专利技术提供了一种nk细胞高效扩增培养基及其扩增方法，所述培养基是利用细胞因子组合与nk细胞促增殖肽协同改善dmem基础培养基对nk细胞的扩增效率，结果发现，在二者联合应用下，nk细胞的体外增殖活性明显得到改善，且存在协同效果。
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1.一种NK细胞高效扩增培养基，其特征在于，所述培养基包括如下组分：DMEM基础培养基、5-15ng/mL SCF、5-15ng/mL IL-3、5-15ng/mL G-CSF、5-15ng/mL IFN-γ、20-50ng/mLNK细胞促增殖肽。
2.如权利要求1所述的NK细胞高效扩增培养基，其特征在于，所述NK细胞高效扩增培养基包括如下组分：DMEM基础培养基、5ng/mL SCF、5ng/mL IL-3、5ng/mL G-CSF、5ng/mL IFN-γ、20ng/mL NK细胞促增殖肽。
3.如权利要求1所述的NK细胞高效扩增培养基，其特征在于，所述NK细胞高效扩增培养基包括如下组分：DMEM基础培养基、10ng/mL SCF、10ng/mL IL-3、10ng/mL G-CSF、10ng/mLIFN-γ、30ng/mL NK细胞促增殖肽。
4.如权利要求1所述的NK细胞高效扩增培养基，其特征在于，所述NK细胞高效扩增培养基包括如下组分：DMEM基础培养基、15ng/mL SCF、15ng/mL IL-3、15ng/mL G-CSF、1
5.如权利要求1-4任一项所述的NK细胞高效扩增培养基，其特征在于，所述NK细胞促增殖肽的氨基酸序列为FCSGKIGANVWKDNPRGEKWAGLGPHVRKRRPGQSHCNRNGCQNWRH IAP(SEQ IDNO.1)。
6.一种NK细胞高效扩增方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)是采用NK细胞分离液分选NK细胞。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤1)的详细步骤包括：抽取新鲜健康成人外周血15mL，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离得到外周血单个核细胞，用MACS缓冲液重悬细胞；依次加入NK cell Biotin-Antibody Cocktail和NK cell MicroBead Cocktail作细胞阳性分选，收集富含NK细胞的细胞悬液，用流式细胞术检测CD3-CD56+CD16+NK细胞纯度。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)是采用摇瓶培养收集NK细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤2)的详细步骤包括采用所述的NK细胞高效扩增培养基对步骤1)中的CD3-CD56+CD16+NK细胞重悬制成细胞密度为1×105/mL的细胞悬浮液，接种于培养瓶中，在37℃、5％CO2条件下培养，每间隔2天进行半量换液，连续培养1周后，收集NK细胞。
...【技术特征摘要】
1.一种nk细胞高效扩增培养基，其特征在于，所述培养基包括如下组分：dmem基础培养基、5-15ng/ml scf、5-15ng/ml il-3、5-15ng/ml g-csf、5-15ng/ml ifn-γ、20-50ng/mlnk细胞促增殖肽。
2.如权利要求1所述的nk细胞高效扩增培养基，其特征在于，所述nk细胞高效扩增培养基包括如下组分：dmem基础培养基、5ng/ml scf、5ng/ml il-3、5ng/ml g-csf、5ng/ml ifn-γ、20ng/ml nk细胞促增殖肽。
3.如权利要求1所述的nk细胞高效扩增培养基，其特征在于，所述nk细胞高效扩增培养基包括如下组分：dmem基础培养基、10ng/ml scf、10ng/ml il-3、10ng/ml g-csf、10ng/mlifn-γ、30ng/ml nk细胞促增殖肽。
4.如权利要求1所述的nk细胞高效扩增培养基，其特征在于，所述nk细胞高效扩增培养基包括如下组分：dmem基础培养基、15ng/ml scf、15ng/ml il-3、15ng/ml g-csf、15ng/mlifn-γ、50ng/ml nk细胞促增殖肽。
5.如权利要求1-4任一项所述的nk细胞高效扩增培养基，其特征在于，所述nk细...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋学斐，刘聪，周闻，
申请(专利权)人：新疆赛尔托马斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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