【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞培养，特别涉及一种伽马代尔塔t细胞高效扩增方法。
技术介绍
1、伽马代尔塔t细胞是t细胞抗原受体(t cell antigen receptor，tcr)由γ和δ链组成的t细胞，广泛分布于机体外周血和黏膜组织中。与αβt细胞不同，γδt细胞识别抗原不需要特异性抗原刺激，可以快速识别外源性病菌及内源应激配体，启动适应性免疫应答。此外，γδt细胞还具有抗感染、分泌细胞因子和趋化因子等能力，广泛参与感染、过敏和肿瘤等疾病的免疫应答。
2、近年来，大量研究表明γδt细胞在体内外均有较好的抗肿瘤效应，为γδt细胞的肿瘤细胞免疫治疗提供了理论依据，显示其广阔的应用前景。在生理情况下，γδt细胞仅占人体外周血t细胞的1-10％，不足以发挥其抗肿瘤作用。如何通过体外扩增的方法获得高纯度、高数量、安全的γδt细胞，进行肿瘤细胞免疫治疗是近年来研究的热点。
技术实现思路
1、针对现有技术所存在的技术问题，本专利技术提供了一种伽马代尔塔t细胞高效扩增方法。本专利技术所述方法是联合使用促进伽马代尔塔t细胞高效扩增细胞因子和相关促增殖蛋白协同用于提高伽马代尔塔t细胞的体外扩增效率，且该细胞可有效抑制肿瘤细
2、胞的生长，为细胞免疫治疗提供了便利。
3、具体而言，本专利技术首先提供了一种伽马代尔塔t细胞高效扩增方法，所述的方法包括如下步骤：
4、1)外周血单个核细胞的分离；
5、2)伽马代尔塔t细胞分离；
6、3)将步骤
7、优选地，步骤1)中的外周血单个核细胞的分离方法包括：取外周血，1500-2000rpm/min离心10-20分钟，吸取上层血浆，56℃灭活30-60分钟后离心备用；采用人淋巴细胞分离液重悬血细胞沉淀，2000-3000rpm/min离心15-30分钟，得到外周血单个核细胞。
8、优选地，步骤2)伽马代尔塔t细胞分离方法包括：向步骤1)外周血单个核细胞中加入抗γδtcr抗体包被的免疫磁珠，混匀后4℃孵育2-4小时，孵育结束后，将其置于分选磁场中，经磁分离和洗脱后，得到伽马代尔塔t细胞。
9、优选地，步骤3)的培养方法包括：将步骤2)得到的伽马代尔塔t细胞采用增殖诱导培养液重悬，并在5％co2、37℃条件下进行细胞培养，每2天换新鲜培养液，连续培养一周后，即可得到高纯度、高细胞毒活性的伽马代尔塔t细胞。
10、优选地，步骤3)中采用的增殖诱导培养液是采用改良的t细胞无血清培养基(xeno-free)，其添加组分包括：10-100ng/ml il-2、10-100ng/ml il-6、10-100ng/ml il-7、20-200ng/ml g-csf、20-200ng/ml tpo、1-10μg/ml makp3蛋白、1-10μg/ml cd59蛋白。
11、本专利技术的另一目的在于提供了一种体外诱导伽马代尔塔t细胞增殖的增殖诱导培养液，其特征在于，所述增殖诱导培养液是采用改良的t细胞无血清培养基(xeno-free)，并添加有il-2、il-6、il-7、g-csf、tpo、makp3蛋白和cd59蛋白。
12、优选地，所述il-2、il-6、il-7的使用浓度优选为10-100ng/ml。
13、优选地，所述g-csf、tpo的使用浓度为20-200ng/ml。
14、优选地，所述makp3蛋白和cd59蛋白的使用浓度为1-10μg/ml。
15、进一步地，本专利技术的另一目的在于提供了上述伽马代尔塔t细胞高效扩增方法在制备伽马代尔塔t细胞扩增试剂盒中的应用；所述伽马代尔塔t细胞扩增试剂盒内的试剂包括所述增殖诱导培养液。
16、进一步地，本专利技术的另一目的在于提供了上述伽马代尔塔t细胞高效扩增方法在制备细胞免疫药物中的应用。
17、本专利技术的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：本专利技术是通过改良商业化的t细胞无血清培养基(xeno-free)，通过引入促进伽马代尔塔t细胞高效扩增细胞因子和相关促增殖蛋白协同用于提高伽马代尔塔t细胞的体外扩增效率，结果显示：联合使用上述细胞因子和蛋白会明显提升伽马代尔塔t细胞的体外扩增倍数，且细胞毒性分析可知，经本专利技术所述方法制备得到的伽马代尔塔t细胞可有效抑制肿瘤细胞的生长，对其杀伤效果也会随着细胞的使用量而呈现上升趋势，为细胞免疫治疗提供了便利。
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1.一种伽马代尔塔T细胞高效扩增方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中的外周血单个核细胞的分离方法包括：取外周血，1500-2000rpm/min离心10-20分钟，吸取上层血浆，56℃灭活30-60分钟后离心备用；采用人淋巴细胞分离液重悬血细胞沉淀，2000-3000rpm/min离心15-30分钟，得到外周血单个核细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)伽马代尔塔T细胞分离方法包括：向步骤1)外周血单个核细胞中加入抗γδTCR抗体包被的免疫磁珠，混匀后4℃孵育2-4小时，孵育结束后，将其置于分选磁场中，经磁分离和洗脱后，得到伽马代尔塔T细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)的培养方法包括：将步骤2)得到的伽马代尔塔T细胞采用增殖诱导培养液重悬，并在5％CO2、37℃条件下进行细胞培养，每2天换新鲜培养液，连续培养一周后，即可得到高纯度、高细胞毒活性的伽马代尔塔T细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中采用的增殖诱导培养液是
6.一种体外诱导伽马代尔塔T细胞增殖的增殖诱导培养液，其特征在于，所述增殖诱导培养液是采用改良的T细胞无血清培养基(Xeno-free)，并添加有IL-2、IL-6、IL-7、G-CSF、TPO、MAKP3蛋白和CD59蛋白。
7.如权利要求6所述的增殖诱导培养液，其特征在于，所述IL-2、IL-6、IL-7的使用浓度优选为10-100ng/ml。
8.如权利要求6所述的增殖诱导培养液，其特征在于，所述G-CSF、TPO的使用浓度为20-200ng/ml。
9.如权利要求6所述的增殖诱导培养液，其特征在于，所述MAKP3蛋白和CD59蛋白的使用浓度为1-10μg/ml。
10.权利要求1-5任一项所述的伽马代尔塔T细胞高效扩增方法在制备伽马代尔塔T细胞扩增试剂盒中的应用，其特征在于，所述伽马代尔塔T细胞扩增试剂盒内的试剂包括权利要求6-9任一项所述增殖诱导培养液。
...【技术特征摘要】
1.一种伽马代尔塔t细胞高效扩增方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中的外周血单个核细胞的分离方法包括：取外周血，1500-2000rpm/min离心10-20分钟，吸取上层血浆，56℃灭活30-60分钟后离心备用；采用人淋巴细胞分离液重悬血细胞沉淀，2000-3000rpm/min离心15-30分钟，得到外周血单个核细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)伽马代尔塔t细胞分离方法包括：向步骤1)外周血单个核细胞中加入抗γδtcr抗体包被的免疫磁珠，混匀后4℃孵育2-4小时，孵育结束后，将其置于分选磁场中，经磁分离和洗脱后，得到伽马代尔塔t细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)的培养方法包括：将步骤2)得到的伽马代尔塔t细胞采用增殖诱导培养液重悬，并在5％co2、37℃条件下进行细胞培养，每2天换新鲜培养液，连续培养一周后，即可得到高纯度、高细胞毒活性的伽马代尔塔t细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中采用的增殖诱导培养液是采用改良的t细胞无血清培养基(xeno-free)，其添加组分包括：10-...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋学斐，刘聪，周闻，
申请(专利权)人：新疆赛尔托马斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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