【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，尤其是一种生物法从头合成鸟嘌呤的方法。
技术介绍
1、鸟嘌呤是常见碱基之一，在医药、生物行业应用广泛，主要用作抗病毒药物阿昔洛韦中间体，硫鸟嘌呤、开环鸟嘌呤的中间体。现有技术中合成鸟嘌呤的方法主要分为两类，一是化学合成，具有质量差，环保压力大，反应条件苛刻等缺点，二是采用鸟苷为原料，以醋酸为溶剂，在无水条件下，通过醋酐与鸟苷反应，制备鸟嘌呤，该方法应用较广，但其生产成本较高，限制了其进一步发展。
2、近年来，随着crispr-cas9编辑技术的出现，为生物基因工程行业带来了诸多便利，这为鸟嘌呤的生物法从头合成提供了可能性也为合成鸟嘌呤提供一种新的合成途径。与现有的技术中的鸟嘌呤合成方法相比，例如公告号为cn110396093b的中国专利公开了一种鸟嘌呤的制备方法。该专利以废弃鱼鳞为原料，充分利用了鱼鳞的自然资源，通过破碎、研磨得到粉末，再通过低温高压处理，使鱼鳞颗粒的表面更加粗糙，甚至出现极其细微的孔隙，然后以盐酸溶液为萃取剂，在超声-微波协同萃取作用下溶出鸟嘌呤，还在后续氢氧化钠溶液进一步分离出鸟嘌呤，通过本专利技术提供的制备方法能获得产量和质量较高的鸟嘌呤。该专利采用提取法生产鸟嘌呤，生产过程中需要使用强酸强碱、低温高压等条件，这对环境会造成一定的污染，而且生产条件较为苛刻。公开号cn 111440170 a的中国专利公开了具体涉及一种利用鸟苷合成鸟嘌呤的方法。该专利将醋酸酐、鸟苷和硼酸反应，得到二乙酰鸟嘌呤和四乙酰核糖；二乙酰鸟嘌呤在碱性条件下反应得到鸟嘌呤；该方法在制备二乙酰鸟嘌呤时条
技术实现思路
1、为了解决现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种生物法从头合成鸟嘌呤的方法。该合成方法反应条件温和，节省了大量的生产成本，减少了环境污染，为合成鸟嘌呤提供一种新的合成途径。
2、为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、一种生物法从头合成鸟嘌呤的方法，其特征在于，所述生物法从头合成鸟嘌呤的方法通过微生物利用挡板三角瓶进行摇瓶发酵培养生产鸟嘌呤；所述微生物为菌株g-6，所述菌株g-6是利用基因工程方法改造大肠杆菌w3110基因组并导入鸟苷水解酶质粒ptrc99ag构建得到。
4、所述基因工程改造方法为crispr-cas9基因编辑技术。
5、优选的，所述菌株g-6构建的具体过程如下：
6、(1)以野生型大肠杆菌w3110为出发菌株，首先敲除guad基因，阻断了鸟嘌呤代谢途径，并在该位点整合了来源于解淀粉芽孢杆菌的嘌呤操纵子(purekbcsqlgmnhd)加强嘌呤合成途径，即得菌株g-0；
7、(2)以所述步骤(1)中菌株g-0为基础，继续敲除purr基因，解除嘌呤途径关键阻遏蛋白，并在该位点整合来源于枯草芽孢杆菌的purf基因，由trc启动子控制基因表达，加强5-磷酸核糖-1-焦磷酸(prpp)的进一步转酰胺的能力，即得菌株g-1；
8、(3)以所述步骤(2)中菌株g-1为基础，使用pbba-j23117启动子替换pura基因原有启动子控制基因表达，削弱了流向腺苷支路的代谢流量，即得菌株g-2；
9、(4)以所述步骤(3)中菌株g-2为基础，继续在mbha与yciq假基因位点处整合点突变处理的大肠杆菌自身prs基因，对该基因进行双拷贝操作，加强prpp合成能力，即得菌株g-3；
10、(5)以所述步骤(4)中菌株g-3为基础，继续敲除gpt与hpt基因，并在gpt基因位点整合guaa、hpt与deod基因，所述guaa、hpt与deod基因首尾相连由同一个ptrc启动子控制基因表达，敲除了鸟嘌呤向gmp的回补途径，并加强了流向鸟嘌呤的代谢流量即得菌株g-4；
11、(6)以所述步骤(5)中菌株g-4为基础，继续敲除yjcd和ygfq基因，削弱鸟嘌呤的内转运蛋白，并在yjcd基因处整合pbue基因，加强了鸟嘌呤的外排能力，在ygfq基因处整合sure基因，加强了鸟苷的合成能力，即得菌株g-5；
12、(7)以所述步骤(6)中菌株g-5为基础，导入鸟苷水解酶质粒ptrc99ag，得到菌株g-6。
13、优选的，所述步骤(1)中嘌呤操纵子包括以下基因：pure、purk、purb、purc、purs、purq、purl、purg、purm、purn、purh、purd，上述12个基因首尾相连，均由同一个ptrc启动子控制基因表达。
14、优选的，所述步骤(2)中purf基因整合的方法为：将所述purf基因第293位天冬氨酸被缬氨酸替代(878位碱基a替换为t)，第316赖氨酸被谷氨酰胺替代(946位碱基a替换为c)，第400位丝氨酸被替换为色氨酸(1199位碱基c替换为g)，解除了其受腺苷酸与鸟苷酸的反馈抑制。
15、优选的，所述步骤(3)中的点突变为将大肠杆菌自身prs基因的第128位的天冬氨酸替代为丙氨酸(386位碱基a替换为c)，并由trc启动子控制基因表达。
16、优选的，所述步骤(6)中pbue基因来源于解淀粉枯草芽孢杆菌，由trc启动子控制基因表达；所述sure基因来源于大肠杆菌自身，由trc启动子控制基因表达。
17、优选的，所述鸟苷水解酶质粒ptrc99ag使用ptrc99a质粒为载体，携带来源于布氏椎虫的鸟苷水解酶基因，所述鸟苷水解酶基因的基因编号为xm_838796.1；所述鸟苷水解酶基因经过密码子优化，使其适合在大肠杆菌中表达。
18、所述步骤(7)中导入鸟苷水解酶质粒ptrc99ag的方法为电转化法，为本领域常规通用方法。
19、优选的，所述摇瓶发酵培养的工艺具体为：
20、步骤s1、采用5ml种子培养基摇管接种菌株g-6，37℃培养12h，得到种子液。
21、步骤s2、配置30ml摇瓶培养基，然后将所述摇瓶培养基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生物法从头合成鸟嘌呤的方法，其特征在于，所述生物法从头合成鸟嘌呤的方法通过微生物利用挡板三角瓶进行摇瓶发酵培养生产鸟嘌呤；所述微生物为菌株G-6，所述菌株G-6是利用基因工程方法改造大肠杆菌W3110基因组并导入鸟苷水解酶质粒pTrc99aG构建得到。
2.根据权利要求1所述的一种生物法从头合成鸟嘌呤的方法，其特征在于，所述菌株G-6构建的具体过程如下：
3.根据权利要求2所述的一种生物法从头合成鸟嘌呤的方法，其特征在于，所述步骤(1)中嘌呤操纵子包括以下基因：purE、purK、purB、purC、purS、purQ、purL、purG、purM、purN、purH、purD，上述12个基因首尾相连，均由同一个Ptrc启动子控制基因表达。
4.根据权利要求2所述的一种生物法从头合成鸟嘌呤的方法，其特征在于，所述步骤(2)中purF基因整合的方法为：将所述purF基因第293位天冬氨酸被缬氨酸替代，第316赖氨酸被谷氨酰胺替代，第400位丝氨酸被替换为色氨酸。
5.根据权利要求2所述的一种生物法从头合成鸟嘌呤的方法，其特征在
6.根据权利要求2所述的一种生物法从头合成鸟嘌呤的方法，其特征在于，所述步骤(6)中pbuE基因来源于解淀粉枯草芽孢杆菌，由trc启动子控制基因表达，所述surE基因来源于大肠杆菌自身，由trc启动子控制基因表达。
7.根据权利要求1所述的鸟一种生物法从头合成鸟嘌呤的方法，其特征在于，所述鸟苷水解酶质粒pTrc99aG使用pTrc99a质粒为载体，携带来源于布氏椎虫的鸟苷水解酶基因，所述鸟苷水解酶基因的基因编号为XM_838796.1；所述鸟苷水解酶基因经过密码子优化，使其适合在大肠杆菌中表达。
8.根据权利要求1所述的一种生物法从头合成鸟嘌呤的方法，其特征在于，所述摇瓶发酵培养的工艺具体为：
9.根据权利要求8所述的一种生物法从头合成鸟嘌呤的方法，其特征在于，所述步骤S1中种子培养基的原料成分与用量具体如下：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L；所述步骤S2中摇瓶培养基的原料成分与用量具体如下：K2HPO4.3H2O 4g/L，酵母浸粉2.5g/L，MgSO4.7H2O 1.5g/L，蛋白胨1.5g/L，硫酸铵1.5g/L，柠檬酸钠1.0g/L，腺苷0.1g/L，次黄嘌呤0.1g/L，FeSO4.7H2O 10mg/L，MnSO4 5mg/L，VB(1、3、5、12)各2mg/L，IPTG0.1mmoL/L，苯酚红溶液25mL/L。
10.根据权利要求8所述的一种生物法从头合成鸟嘌呤的方法，其特征在于，所述步骤S3中所述摇瓶发酵的培养条件为：培养温度为37℃，pH为7.2，恒温震荡培养箱的转速为220r/min。
...【技术特征摘要】
1.一种生物法从头合成鸟嘌呤的方法，其特征在于，所述生物法从头合成鸟嘌呤的方法通过微生物利用挡板三角瓶进行摇瓶发酵培养生产鸟嘌呤；所述微生物为菌株g-6，所述菌株g-6是利用基因工程方法改造大肠杆菌w3110基因组并导入鸟苷水解酶质粒ptrc99ag构建得到。
2.根据权利要求1所述的一种生物法从头合成鸟嘌呤的方法，其特征在于，所述菌株g-6构建的具体过程如下：
3.根据权利要求2所述的一种生物法从头合成鸟嘌呤的方法，其特征在于，所述步骤(1)中嘌呤操纵子包括以下基因：pure、purk、purb、purc、purs、purq、purl、purg、purm、purn、purh、purd，上述12个基因首尾相连，均由同一个ptrc启动子控制基因表达。
4.根据权利要求2所述的一种生物法从头合成鸟嘌呤的方法，其特征在于，所述步骤(2)中purf基因整合的方法为：将所述purf基因第293位天冬氨酸被缬氨酸替代，第316赖氨酸被谷氨酰胺替代，第400位丝氨酸被替换为色氨酸。
5.根据权利要求2所述的一种生物法从头合成鸟嘌呤的方法，其特征在于：所述步骤(3)中点突变为将大肠杆菌自身prs基因的第128位的天冬氨酸替代为丙氨酸，并由trc启动子控制基因表达。
6.根据权利要求2所述的一种生物法从头合成鸟嘌呤的方法，其特征在于，所述步骤(6)中pbue基因来源于解淀粉枯草芽孢杆菌，由trc启动子...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵成源，杨树勋，张荣华，徐庆阳，杨思豪，白林霞，
申请(专利权)人：新乡瑞诚科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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