【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于马养殖，具体涉及一种判定公马精子质量、提高受孕率的方法。
技术介绍
1、目前，种马产业的精细化饲养已成为主要的发展趋势。种马的饲喂、环境控制等都已有大规模的传感器电子技术的应用。但公马的配种及采精时间还是通过公马的发情情况判定，发情目前仍大多沿用传统的鉴定方法，依赖人工操作，主要表现为公马爬跨法。这种方法不仅效率较低，还存在生物安全隐患，不仅增加了劳动力，也限制了生产效益的提高。最重要的是，人工查情对工作人员的专业素养和种马饲养经验均有较高的要求。繁育优良品种马是马场的生产目标，公马精子的质量直接影响母马受精怀胎率，更是一个马场效益的关键指标，公马最优配种/采精时期的判断是提高繁殖效率和生产效益的重要技术措施。
2、公马性成熟后就开始发情一般到4岁才能正式配种，属季节性多次发情动物，一般在每年的3～6月份进入发情旺期。准确科学地掌握公马发情中高质量精子的状况，可以有效地减少公马非生产天数，可为马场减少不必要的饲料成本开支、工人反复查情等成本。在公马发情周期内，准确掌握公马发情中高质量精子的状态并进行配种/采精，有利于确定较佳的受孕时间/取得质量较好的精子，对提高母马的怀胎率非常重要。因此，针对公马进行快速无应激的公马精子质量鉴定具有重要作用。公马发情时，葡萄糖醛酸结合的雄激素代谢物在公马尿液中含量显著提高，该指标可以作为测试指标，进行公马精子质量辅助检测。
技术实现思路
1、针对以上问题，本专利技术提供一种无接触式、无应激式、福利化的判断公马精子质量的方法
2、本专利技术通过以下技术方案实现：
3、一种判断公马精子质量的方法，包括如下步骤：第一步，采集公马尿，将尿液离心、固相萃取，得甲醇洗脱液；
4、第二步，采用液质联用分析仪对第一步中得到甲醇洗脱液进行含量检测；
5、第三步，将每匹公马每次采集尿液中睾酮葡萄糖醛酸、雄酮葡萄糖醛酸和雄甾二醇葡萄糖醛酸的含量通过excel、simca-p拟合参考曲线，通过公马爬跨法验证检测结果，确定高质量公马精子时的睾酮葡萄糖醛酸、雄酮葡萄糖醛酸和雄甾二醇葡萄糖醛酸的区间阈值；
6、第四步，根据检测到睾酮葡萄糖醛酸、雄酮葡萄糖醛酸和雄甾二醇葡萄糖醛酸的含量是否在发情阈值内，判断公马精子质量。
7、所述第一步中，离心转速为3000～5000转/分钟，离心时间为10-20分钟。
8、固相萃取采用c18层析柱，先将马尿加入色谱柱，然后依次采用去离子水和甲醇进行洗脱，最终得到甲醇洗脱液；其中马尿、去离子水和甲醇的体积比为1：1：1～1：2：2。
9、所述第二步中：液相色谱测定条件为：色谱柱为c18；
10、以0.05％-0.5％甲酸溶液为流动相a、乙腈为流动相b进行梯度洗脱，流速为0.1-0.5ml/min，柱温为30-50℃，运行时长为30-50min，进样量为1μl；
11、质谱条件为：电喷雾离子源(esi)，负离子模式，扫描方式为数据依赖性监测ida，喷雾电压为-4500v，喷雾温度为550℃；
12、雾化气种类gas1：55psi；
13、辅助气种类gas2：55psi；
14、碰撞气种类cad gas：7psi；
15、气帘气种类curtain gas：35psi；
16、去簇电压dp：-80v；
17、碰撞电压ce：-35v；
18、扫描分子量范围：10-1000da。
19、梯度洗脱的程序为：洗脱梯度为：0-3min：95％流动相a+5％流动相b；
20、3-10min：90％流动相a+10％流动相b；
21、10-30min：85％流动相a+15％流动相b；
22、30-36min：75％流动相a+25％流动相b；
23、36-38min：50％流动相a+50％流动相b；
24、38-42min：10％流动相a+90％流动相b；
25、42-42.1min：95％流动相a+5％流动相b；
26、42.1-45min：95％流动相a+5％流动相b。
27、将每匹公马每次采集尿液中睾酮葡萄糖醛酸、雄酮葡萄糖醛酸和雄甾二醇葡萄糖醛酸的含量通过excel、simca-p拟合参考曲线等，通过质谱检测下同m/z多组分数据构建公马精子质量的主成分分析模型，最后通过公马爬跨法验证检测结果，确定了高质量公马精子时的睾酮葡萄糖醛酸、雄酮葡萄糖醛酸和雄甾二醇葡萄糖醛酸的区间阈值。
28、所述睾酮葡萄糖醛酸的高质量公马精子区间阈值为40～120μg/ml，所述雄酮葡萄糖醛酸的高质量公马精子区间阈值为5～50μg/ml，所述雄甾二醇葡萄糖醛酸的高质量公马精子区间阈值为5～40μg/ml。
29、若睾酮葡萄糖醛酸、雄酮葡萄糖醛酸和雄甾二醇葡萄糖醛酸的含量均低于或等于其对应的高质量公马精子区间阈值，则判定所测公马精子质量低；
30、若睾酮葡萄糖醛酸、雄酮葡萄糖醛酸和雄甾二醇葡萄糖醛酸中的一种的含量高于其对应的发情区间阈值，则判定所测公马精子质量高。
31、本专利技术的方法可与公马爬跨法等人工查情方法结合使用，也可单独使用。
32、本专利技术的方法中，采集待测公马的尿液为从部分公马出现爬跨行为后开始采集尿液。
33、本专利技术中，所述待测公马的品种为蒙古马。所述待测公马为年龄4～5年的公马。
34、本专利技术还提供所述判断公马精子质量的方法在公马配种/采精及提高母马受胎率中的应用。
35、公马精子质量低，则公马与母马交配后，母马的受孕率低；公马精子质量高，则公马与母马交配后，母马的受孕率高。
36、本专利技术的有益效果在于：本专利技术的有益效果为：
37、1、本专利技术中通过检测马尿中标志物的量，来判断公马精子质量，样品采集简单，且对马匹没有创伤。
38、2、采用lc-ms的方法对样品进行检测，检测快速、准确。
39、3、马尿的处理简单，进行简单离心、固相萃取即可进样检测，不需要对马尿进行复杂处理，比如调节ph值或加入某种成分，比较节能环保。
40、4、本专利技术提供的判断公马精子质量的方法通过将待测公马尿液中睾酮葡萄糖醛酸、雄酮葡萄糖醛酸和雄甾二醇葡萄糖醛酸的含量与其对应的发情区间阈值进行对比来预测公马精子质量，还可根据睾酮葡萄糖醛酸、雄酮葡萄糖醛酸和雄甾二醇葡萄糖醛酸含量变化的曲线走势图预计未来高质量公马精子的时间。
41、5、通过公马尿液中m/z＝463、m/z＝465、m/z＝467下的雄激素葡萄糖醛酸结合物能够更好的呈现公马由于发情作用引起的激素水平变化情况，可将这些组分作为公马精子质量本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种判定公马精子质量的方法，其特征在于，包括如下步骤：第一步，采集公马尿液，将尿液离心、固相萃取，得甲醇洗脱液；
2.根据权利要求1所述判定公马精子质量的方法，其特征在于，所述第一步中，离心转速为3000～5000转/分钟，离心时间为10-20分钟。
3.根据权利要求1所述判定公马精子质量的方法，其特征在于，所述第一步中，固相萃取采用C18柱，先将马尿加入C18柱，然后依次采用去离子水和甲醇进行洗脱，最终得到甲醇洗脱液；其中，马尿、去离子水和甲醇的体积比为1：1：1～1：2：2。
4.根据权利要求1所述判定公马精子质量的方法，其特征在于，所述第二步中，液相色谱测定条件为：色谱柱为C18；
5.根据权利要求4所述判定公马精子质量的方法，其特征在于，梯度洗脱的程序为：洗脱梯度为：0-3min：95％流动相A+5％流动相B；
6.根据权利要求1所述判定公马精子质量的方法，其特征在于，在所述第三步中，所述睾酮葡萄糖醛酸的高质量公马精子区间阈值为40～120μg/ml，所述雄酮葡萄糖醛酸的高质量公马精子区间阈值为5～50μg/
7.根据权利要求1所述判定公马精子质量的方法，其特征在于，在所述第四步中，睾酮葡萄糖醛酸、雄酮葡萄糖醛酸和雄甾二醇葡萄糖醛酸的含量均低于或等于其对应的高质量公马精子区间阈值，则判定所测公马精子质量低；
8.根据权利要求1所述判定公马精子质量的方法，其特征在于，所述待测公马的品种为蒙古马，所述待测公马为年龄4～5年的公马，公马尿液的采集时间为每年的4月份～5月份。
9.一种如权利要求1-8所述判定公马精子质量的方法在公马配种/采精及提高母马受胎率中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种判定公马精子质量的方法，其特征在于，包括如下步骤：第一步，采集公马尿液，将尿液离心、固相萃取，得甲醇洗脱液；
2.根据权利要求1所述判定公马精子质量的方法，其特征在于，所述第一步中，离心转速为3000～5000转/分钟，离心时间为10-20分钟。
3.根据权利要求1所述判定公马精子质量的方法，其特征在于，所述第一步中，固相萃取采用c18柱，先将马尿加入c18柱，然后依次采用去离子水和甲醇进行洗脱，最终得到甲醇洗脱液；其中，马尿、去离子水和甲醇的体积比为1：1：1～1：2：2。
4.根据权利要求1所述判定公马精子质量的方法，其特征在于，所述第二步中，液相色谱测定条件为：色谱柱为c18；
5.根据权利要求4所述判定公马精子质量的方法，其特征在于，梯度洗脱的程序为：洗脱梯度为：0-3min：95％流动相a+5％流动相b；<...
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