【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，尤其涉及一种基于电致化学发光成像技术的细胞分型方法及其在识别细胞异质性中的应用，本方法可适用于实质细胞分型、免疫细胞分型和其他细胞分型。
技术介绍
1、肝硬化是诸多肝病的终末期阶段，也是目前慢性肝病患者的的主要健康负担。肝硬化通常发生在慢性损伤后，触发肝脏的伤口愈合反应并诱导细胞外基质过度沉积。目前认为肝纤维化发生的机制主要是由于肝星状细胞(hepatic stellate cell,hsc)激活和肌成纤维细胞生成导致的异常伤口愈合反应。目前，由于肝纤维化的关键驱动因素缺乏明确的机制，肝移植仍然是唯一的治疗选择。hsc是肝脏的关键非实质细胞种类之一。hsc产生并分泌许多不同的细胞因子和生长因子，这些细胞因子和生长因子对于正常生理条件下的肝脏稳态以及控制损伤后的肝脏再生至关重要。肝损伤后，hsc会减少过氧化物酶体增殖物激活受体γ等基因的表达，失去脂滴，并通过增加α-sma和i型胶原蛋白的表达来激活成肌成纤维细胞。活化的hsc还发挥其他重要作用，例如释放不同种类的细胞因子来调节炎症、血管活性反应、血管生成，并促进其他肝谱系细胞迁移至损伤部位，以重建肝脏结构和功能。这些不同的作用是由具有多样化功能的不同亚系细胞来实现。目前识别hsc的细胞异质性手段例如单细胞测序准备样本时间长、过程复杂、成本高。因此，我们开发了一种基于电致化学发光成像技术的细胞分型方法。
2、电致化学发光，也叫电致化学发光，是由电致化学反应诱导产生光的一种化学现象。电致化学发光将电致化学和光学巧妙地结合到一起，使其具有独特的优势并引
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种基于电致化学发光的细胞成像方法并探究其在细胞分型方面的应用。
2、一种基于电致化学发光成像技术的细胞分型方法，以三联吡啶钌为发光探针，hepes为共反应剂，在检测时，以ito电极作为发光检测的工作电极、银-氯化银电极作为参比电极；由1.0v扫描至1.35v，检测来自三联吡啶钌的发光信号；本专利技术实现了可调的细胞ecl成像模式，且结合imagej和matlab软件对成像结果进行分析，对不同功能状态的细胞进行分型。
3、优选的，该方法采用可调的细胞ecl成像模式。
4、下面以肝纤维化过程中的关键调控细胞肝星状细胞为例，该方法无需依赖常规的染色、标记、单细胞测序等传统生物学检测技术，通过分析成像结果对不同活化状态的肝星状细胞进行区分。
5、为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
6、(1)电致化学工作站的搭建：联用电致化学工作站和光学成像系统用于探测电致化学发光产生的光学信号并成像。ecl反应的进行通过经典的三电极体系控制。其中，ag/agcl(饱和kcl)
7、被用作参比电极，pt片(15mm×15mm×0.1mm)被用作对电极；氧化铟锡(ito)透明导电玻璃被用作工作电极。经典的三电极体系以及电致化学工作站用于施加和触发ru(bpy)32+
8、/hepes体系的电致化学反应同时记录反应的电学信号，工作电极ito具有良好的透光性，随着电压的施加，电致化学反应同步产生的光子可以透过ito电极被高数值孔径的物镜所收集，经过倒置光学显微镜系统最终靶向具有高灵敏度的emccd相机中，从而实现电致化学发光成像。自制的反应槽用于细胞等生物在信号采集过程中应保持环境足够避光。
9、(2)ito的构建：将玻璃盖玻片(厚0.15mm，直径26mm)分别在丙酮、异丙醇和去离子水中超声处理15min，随后用氮气吹干盖玻片，并用氧气等离子体系统进行清洁，以100w的功率和0.6mbar的氧气压力处理4min。将清洗好的盖玻片用磁控溅射系统(dentondiscovery 635)进行导电层的溅射，直流模式功率设置为100w，氩气流速为37sccm，用氧化铟锡靶材(in2o3:sno2＝9:1)溅900s用于生长ito的薄层。在673k温度下真空退火6h用于提高ito的导电性和透光率，最终得到实验所用ito电极。
10、(3)细胞培养与固定：人肝星状细胞(lx2)在37℃和5％ co2下使用高葡萄糖dulbecco改良的eagle培养基(4.5g/l葡萄糖且不含酚红)，即高糖dmem培养基进行培养。培养液中额外加入10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素。然后转移到已经在75％酒精中灭菌10分钟的ito盖玻片上。然后将转移的细胞在37℃和5％ co2条件下在高糖dmem培养基中培养16小时。
11、16小时后，换液，并用不同浓度(0、5、10、20ng/ml)的tgf-β1进行刺激24小时。在实验前，用预冷的pbs缓冲液洗涤2次，再用4％多聚甲醛(pfa)的pbs溶液在4℃下固定10分钟，然后用冷pbs缓冲液洗涤2次，之后用于电致化学发光成像实验。
12、(4)固定化细胞的电致化学发光成像实验：对于固定化细胞的电致化学发光成像，我们采用了100
13、μm ru(bpy)32+和50mm hepes(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)的体系用于ecl成像实验，其功能类似于tpra作为ru(bpy)32+的共反应剂但是对于细胞更为友好，在dulbecco改良的eagle培养基中用于固定细胞的电致化学发光成像实验。将电致化学发光成像条件设置如下：相机曝光时间为5ms，em gain设为500。设置电致化学工作站为多电位阶跃法
14、(multi-potential step)模式，起始电压1.00v，终止电压为1.35v，每隔0.05v为一个台阶，每个电压持续5s，持续观察5s能得到足够稳定的电致化学发光成像结果，若加电时间短于5s，有可能造成成像结果不稳定；加电时间若继续延长，在提高成像质量方面并无助益，且增加采集的时间成本。
15、(5)成像结果处理：随本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于电致化学发光成像技术的细胞分型方法，以三联吡啶钌为发光探针，HEPES为共反应剂，在检测时，以ITO电极作为发光检测的工作电极、银-氯化银电极作为参比电极；由1.0V扫描至1.35V，检测来自三联吡啶钌的发光信号；结合ImageJ和MATLAB软件对成像结果进行分析，对不同功能状态的细胞进行分型。
2.根据权利要求1所述的细胞分型方法，其特征在于：该方法采用可调的细胞ECL成像模式。
3.根据权利要求1所述的细胞分型方法，其特征在于：包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的细胞分型方法，其特征在于：步骤(1)中自制的反应槽是由一个底座和中空的圆柱体形成的一体式结构，在中间镂空部分可放置2个大小匹配的中空金属圆片，后续电致化学发光成像实验的ITO以绝缘胶带固定于金属圆片上，再用一中空橡胶圈置于金属圆片上以防止ITO碎裂，最后加一圆柱形顶盖以固定整体结构用于细胞实验观察。
5.权利要求1所述方法在实质细胞分型、免疫细胞分型和其他细胞分型中的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的。
6.根据权利要求5所述的应用，用于对不
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：包括如下步骤：
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：自制的反应槽是由一个底座和中空的圆柱体形成的一体式结构，在中间镂空部分可放置2个大小匹配的中空金属圆片，后续电致化学发光成像实验的ITO以绝缘胶带固定于金属圆片上，再用一中空橡胶圈置于金属圆片上以防止ITO碎裂，最后加一圆柱形顶盖以固定整体结构用于细胞实验观察。
...【技术特征摘要】
1.一种基于电致化学发光成像技术的细胞分型方法，以三联吡啶钌为发光探针，hepes为共反应剂，在检测时，以ito电极作为发光检测的工作电极、银-氯化银电极作为参比电极；由1.0v扫描至1.35v，检测来自三联吡啶钌的发光信号；结合imagej和matlab软件对成像结果进行分析，对不同功能状态的细胞进行分型。
2.根据权利要求1所述的细胞分型方法，其特征在于：该方法采用可调的细胞ecl成像模式。
3.根据权利要求1所述的细胞分型方法，其特征在于：包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的细胞分型方法，其特征在于：步骤(1)中自制的反应槽是由一个底座和中空的圆柱体形成的一体式结构，在中间镂空部分可放置2个大小匹配的中空金属圆片，后续电致化学发光成像实验的ito以绝缘胶...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑敏，冯建东，张靖康，董金润，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属第一医院，
类型：发明
国别省市：
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