【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学领域，具体涉及一种在肿瘤患者手术新鲜肿瘤组织及石蜡切片肿瘤组织中提取微生物dna、构建16s rrna基因多区域文库及测序的方法。
技术介绍
1、人体是由宿主细胞和微生物共同构成的共生体，人体内微生物的基因大约是人类宿主基因的100倍。随着二代测序(next-generation sequencing，ngs)技术的发展，以往被认为是无菌的肿瘤组织也被证实存在着微生物，且不同肿瘤组织中有着不同的微生物组成，如结直肠癌中梭杆菌属、拟杆菌属、微单胞菌属、普雷沃菌属显著富集；乳腺癌患者肿瘤内假单胞菌属、变形杆菌属、氮单胞菌属有所富集；胃癌患者肿瘤内叶杆菌属、无色杆菌属、柠檬酸杆菌属等显著富集；胰腺癌长生存期患者肿瘤内假黄单胞菌属、链霉菌属、糖多孢菌属及克劳氏芽孢杆菌丰度显著增加。除此之外，肿瘤内微生物与肿瘤的发生发展及转移同样有着紧密联系。
2、目前，肿瘤内微生物组测序手段大致有两种，经典的16s rrna(16s ribosomalrna)基因测序技术及宏基因组鸟枪法测序技术。其中，经典的16s rrna基因测序技术在肿瘤微生物组研究中的应用最为广泛，通过针对微生物16s rrna基因的高保守区设计引物，对可变区进行测序，将下机数据比对到参考基因组，进而获得样本的物种分类、种群结构等信息。然而，由于二代测序读长的限制，目前的方法只能对16s rrna基因9个可变区中的1～2个进行测序，仅占其全长的16％～33％，物种检测的分辨率仅能达到属水平，极少部分微生物可以检测到种水平。宏基因组鸟枪法测序技术虽
3、因此，现有的16s rrna基因文库构建及测序方法仍有待改进。目前需要一种低成本、易操作的16s rrna基因测序方法，使测序区域覆盖率更高，以提高物种分辨率至种水平，为肿瘤微生物组研究提供技术支持。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种肿瘤内微生物dna提取、16s rrna基因多区域文库构建及测序的方法，具有低成本、易操作等特点，能够使测序区域覆盖率更高，提高物种分辨率水平。
2、本专利技术首先保护一种在手术肿瘤组织中提取微生物dna的方法，可依次包括如下步骤：
3、(1)在胃癌手术标本取材过程中，在一旁放置开盖的无菌冻存管，作为手术室环境对照；
4、(2)将(1)中的肿瘤组织和手术室环境对照用溶菌酶裂解，同时添加每一批次的提取对照，处理同肿瘤组织；
5、(3)将(2)中的组织和对照样本通过蛋白酶消化、细胞裂解、洗脱得到含微生物dna的肿瘤组织dna。
6、本专利技术还保护一种在石蜡切片肿瘤组织中提取微生物dna的方法，可依次包括如下步骤：
7、(1)每一批次提取添加一个提取对照，处理同石蜡切片胃癌组织；
8、(2)将(1)中的肿瘤组织和提取对照用无毒脱蜡液脱腊；
9、(3)将(2)中的肿瘤组织和提取对照用多聚酶裂解；
10、(3)将(3)中的组织和对照样本通过蛋白酶消化、细胞裂解、洗脱得到含微生物dna的肿瘤组织dna。
11、本专利技术还保护一种肿瘤内微生物16s rrna基因多区域文库构建及测序的方法，可依次包括如下步骤：
12、(1)设计用于构建16s rrna基因多区域测序文库的引物，所述引物包括序列1、序列2、序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、序列9、序列10；
13、(2)使用(1)中所述引物对基因组dna进行扩增并纯化扩增产物；
14、(3)将(2)中的纯化产物用含有不同标签的index引物进行扩增，所述引物包括序列11、序列12，纯化扩增产物；
15、(4)对(3)中文库进行质检，质检合格的文库根据每个样本的数据量要求，进行相应比例混合后，采用illumina novaseq高通量测序平台完成16s rrna基因多区域测序，测序模式为pe 150。序列11、序列12的8个n表示8bp的随机碱基，可作为随机标签。
16、本专利技术还保护以上所述方法构建得到的dna文库。
17、本专利技术还保护一种用于构建16s rrna基因多区域文库的试剂盒，包括上述任一所述的引物混合物。所述用于构建测序文库的试剂盒具体可由上述任一所述的引物混合物组成。
18、上述试剂盒还可包括用于dna提取的试剂、用于dna建库的试剂、用于文库纯化的试剂、用于文库扩增的试剂、用于文库质检的试剂等用于文库构建的材料。
19、本专利技术还保护上述试剂盒在检测肿瘤内微生物组成中的应用。
20、上述应用中，所述肿瘤可为胃部恶性肿瘤，即胃癌。
21、本专利技术还保护一种针对16s rrna基因多区域测序数据的生物信息学分析方法，可依次包括如下步骤：
22、(1)根据分子标签从原始下机数据中拆分出每个样本的原始数据，去除下机数据中的引物序列、低质量序列以及嵌合体序列后获得的高质量序列；
23、(2)将16s rrna基因序列进行拼接、比对，划分出otu，将每个otu中的代表性序列在silva数据库中进行注释，并生成otu表格，过滤掉相对丰度小于10-4的物种；
24、(3)对(2)中结果进行组内组间统计比较分析等，多角度度量样本的微生物群落特征。
25、本专利技术提供了一种可以高分辨率检测肿瘤内微生物组成的方法，该方法基于经典的16s rrna基因测序技术，对微生物16s rrna基因9个可变区中的5个可变区进行特异性扩增，显著提高了肿瘤组织中检出的otu数目、种群多样性及分辨率，成本与经典方法相比基本不变，更加适用于低微生物载量、高宿主dna含量的肿瘤组织样本，更能反映样本真实微生物组成情况。同时，文库的构建方法不仅适用于肿瘤内微生物dna样本，也适用于其他痕量微生物样本类型的基因组dna样本.本专利技术为肿瘤内微生物组研究提供了理论支撑及技术支持。
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1.一种在手术肿瘤组织中提取微生物DNA的方法，可依次包括如下步骤：
2.一种在石蜡切片肿瘤组织中提取微生物DNA的方法，可依次包括如下步骤：
3.一种肿瘤内微生物16S rRNA基因多区域文库构建及测序的方法，可依次包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的index中的标签是由8个随机碱基N构成的序列，每个随机碱基N选自A、T、G、C中的任意一个碱基。
5.根据权利要求3所述的方法构建得到的DNA文库。
6.一种用于构建16S rRNA基因多区域测序文库的试剂盒，包括权利要求3中所述的引物混合物。
7.权利要求3中所述的引物组合用于检测手术肿瘤组织、石蜡切片肿瘤组织DNA样本中微生物组成的应用。
8.一种针对16S rRNA基因多区域测序数据的生物信息学分析方法，可依次包括如下步骤：
【技术特征摘要】
1.一种在手术肿瘤组织中提取微生物dna的方法，可依次包括如下步骤：
2.一种在石蜡切片肿瘤组织中提取微生物dna的方法，可依次包括如下步骤：
3.一种肿瘤内微生物16s rrna基因多区域文库构建及测序的方法，可依次包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的index中的标签是由8个随机碱基n构成的序列，每个随机碱基n选自a、t、g、...
【专利技术属性】
技术研发人员：杜春霞，李昱潼，焦宇辰，王小兵，
申请(专利权)人：中国医学科学院肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：
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