【技术实现步骤摘要】
本申请涉及细菌源性囊泡检测，特别是涉及一种检测细菌源性囊泡的方法和试剂。
技术介绍
1、肠道菌群是人体肠道内微生物群落的总称。肠道菌群包含几百甚至上千种不同的微生物，其基因总数是人类基因总数的100多倍。肠道菌群是近年来研究的热点和前沿，其在肠道进行局部相互信息交流、对宿主肠道生理、病理状态进行局部调控，因此肠道菌群又被称为人体的“新器官”。大量研究通过宏基因组分析证实，肠道菌群稳态与营养不良、肥胖症、糖尿病、阿尔兹海默病等全身性疾病息息相关，这提示着肠道菌群也有可能可以远程对宿主的其他器官和组织的生理、病理过程发挥关键调控作用。这些前期研究为肠道细菌与宿主跨物种之间相互作用具体机制及因果关系的探讨提供了科学依据。然而，为了更深入地理解肠道菌群与宿主生理、病理状态之间的内在联系，从肠道菌群与疾病的相关性聚焦到两者相互作用具体分子机制是本领域的重要发展趋势。
2、肠道细菌除了可通过毒力因子以及代谢产物(如短链脂肪酸)参与宿主疾病的发生发展外，近年来，越来越多研究表明，细菌分泌的细菌源性囊泡(bacterialextracellular vesicles,bevs)在细菌群体行为和跨物种间通讯起着重要的作用。bevs是直径范围在20～400nm的脂质双层囊状结构，内部除了包含有细菌母体的代谢产物、毒力因子等成分，还携带了大量与细菌母体相同的活性生物大分子。这些囊泡携带了丰富的生物信息，被认为是细菌与细菌之间、细菌与宿主之间相互作用的一个重要的新途径。在肠道细菌之间，它们可以通过bevs进行相互信号传递、毒力因子运输、dn
3、然而，人体循环中bevs的研究，目前仍面临着巨大的技术挑战：1.循环中人源的evs与bevs皆为脂质双分子层结构，其大小、结构、及物理性质相似，目前缺乏对bevs特异且普适的生物标志物；2.血液成分复杂，总evs含量相对较低，若要将bevs从总evs中区别检测出来，亟需高灵敏、单颗粒精度的检测分析技术。已有研究通过高通量测序、elisa等常用的技术对人体循环中的总evs进行检测分析，初步发现人体循环的总evs中含有细菌源性的产物。然而，这些方法仅可实现对evs样本中靶分子的总量进行检测与分析，不仅无法排除循环中免疫细胞吞噬细菌而残留的细菌片段的干扰；更重要的是，这些方法仍无法对循环中的bevs进行单颗粒精度的定量分析，未能为循环中稳定存在bevs提供直接的证据。因此，寻找合适的bevs特征性标志物，建立灵敏、特异且可实现单颗粒精度的bevs检测分析技术对探究生物体内bevs潜在作用至关重要。
技术实现思路
1、本申请的目的是提供一种新的检测细菌源性囊泡的方法和试剂。
2、为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
3、本申请的一方面公开了一种检测细菌源性囊泡的方法，包括将待测囊泡样本溶液与荧光探针混合，恒温孵育，离心获得囊泡沉淀，用缓冲液将囊泡沉淀重悬；采用生物颗粒检测平台分析重悬的囊泡溶液中与荧光探针结合的囊泡的数量和占比，即细菌源性囊泡的数量和占比；其中，荧光探针为荧光标记的脂多糖抗体和荧光标记的脂磷壁酸抗体。本申请中，脂多糖抗体是能够特异性的识别和结合脂多糖(lipopolysaccharide,lps)的抗体，脂磷壁酸抗体是能够特异性的识别和结合脂磷壁酸(lipoteichoic acid,lta)的抗体。
4、需要说明的是，本申请创造性的采用荧光标记的脂多糖抗体和荧光标记的脂磷壁酸抗体作为荧光探针，特异性的对细菌源性囊泡进行荧光标记，然后采用生物颗粒检测平台分析样本中的总evs数量和荧光标记的evs数量，以及荧光标记evs占总evs的占比，该荧光标记的evs数量和占比，即细菌源性囊泡的数量和占比。本申请的检测方法，不仅能够准确无误的检测细菌源性囊泡数量及其占比，还能够精确的对单颗粒的细菌源性囊泡进行检测和统计，灵敏度高、特异性强，能够作为循环中稳定存在bevs的直接证据，为探究生物体内bevs及其作用提供了一种新的方案和途径。
5、本申请的一种实现方式中，每107-109颗粒的待测囊泡对应添加4-6μg荧光探针。
6、需要说明的是，本申请的检测方法中，荧光探针的作用是特异性的识别和标记细菌源性囊泡；原则上需要加入充分过量的荧光探针，以确保所有细菌源性囊泡都被有效识别和标记。因此，本申请优选的每107-109颗粒的待测囊泡对应添加4-6μg荧光探针。可以理解，根据具体的待测囊泡样本中囊泡的数量，可以在该比例范围内进行适当调整，只要能够确保所有细菌源性囊泡都被有效识别和标记即可。
7、本申请的一种实现方式中，恒温孵育的温度为35-40℃。
8、优选的，恒温孵育的时间为10-30min。
9、需要说明的是，本申请的检测方法中，恒温孵育的作用是使荧光探针能够有效的识别和标记细菌源性囊泡，即使脂多糖抗体和脂磷壁酸抗体能够有效的结合在脂多糖和脂磷壁酸上。
10、本申请的一种实现方式中，恒温孵育后的离心条件为，2-8℃，95000-160000g离心35-70min。
11、需要说明的是，恒温孵育后的离心主要是为了使囊泡被离心沉淀，以此方法去除溶液中过量的荧光探针，以确保后续检测的准确性；可以理解，基于这样的考虑，如果在后续检测时荧光背景仍然很强，可以进一步的采用缓冲液对沉淀进行至少1次清洗，然后采用相同的离心条件进行离心获得沉淀用于后续检测。
12、本申请的一种实现方式中，缓冲液为pbs或生理盐水。
13、需要说明的是，本申请采用的缓冲液一方面主要是为了确保囊泡的稳定性，使其不被破坏；另一方面，主要是为后续生物颗粒检测平台检测提供溶液环境。因此，原则上能够满足以上两者的缓冲液都能够用于本申请，不仅限于pbs或生理盐水。
14、本申请的一种实现方式中，生物颗粒检测平台为纳米流式检测仪。
15、需要说明的是，纳米流式检测仪只是本申请的一种实现方式中具体采用的生物颗粒检测平台，原则上，只要能够准确有效的对囊泡和荧光标记囊泡进行区分检测的生物颗粒检测平台都能够用于本申请，不仅限于纳米流式检测仪。例如，exocounter、nanoview等全自动外泌体荧光检测分析系统，也可以用于本申请。
16、本申请的一种实现方式中，本申请的检测方法还包括设置所述生物颗粒检测平本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测细菌源性囊泡的方法，其特征在于：包括将待测囊泡样本溶液与荧光探针混合，恒温孵育，离心获得囊泡沉淀，用缓冲液将囊泡沉淀重悬；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：每107-109颗粒的待测囊泡对应添加4-6μg荧光探针。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述恒温孵育的温度为35-40℃；
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述离心的条件为2-8℃，95000-160000g离心35-70min；
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述生物颗粒检测平台为纳米流式检测仪；
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述荧光标记可重复的选自Alexa Fluor488、二氢罗丹明123、四甲基罗丹明-6-马来酰亚胺、四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺、5-吲哚乙酰氨基荧光素、6-羧基-2'4,7,7-四氯荧光素琥珀酰亚胺酯、双[NN-双(羧甲基)氢甲基]荧光素四钠盐、荧光素-5-马来酰亚胺、5-异硫氰酸荧光素尸胺、磺基罗丹明G、7-羟基-4-甲基香豆素、3-氰基-7-羟基香豆素、荧光素二钠盐
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于：所述待测囊泡样本溶液由血清、血浆、漱口液、脑脊液、胸腹水、尿液、肺泡灌洗液、脓液、宫颈拭子或粪便样本中分离获得；
8.一种检测细菌源性囊泡的试剂，其特征在于：包括荧光探针，所述荧光探针为荧光标记的脂多糖抗体和荧光标记的脂磷壁酸抗体。
9.根据权利要求8所述的试剂，其特征在于：所述荧光标记可重复的选自Alexa Fluor488、二氢罗丹明123、四甲基罗丹明-6-马来酰亚胺、四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺、5-吲哚乙酰氨基荧光素、6-羧基-2'4,7,7-四氯荧光素琥珀酰亚胺酯、双[NN-双(羧甲基)氢甲基]荧光素四钠盐、荧光素-5-马来酰亚胺、5-异硫氰酸荧光素尸胺、磺基罗丹明G、7-羟基-4-甲基香豆素、3-氰基-7-羟基香豆素、荧光素二钠盐Fluorescein荧光素、6-荧光素氨基磷酸酯、四甲基罗丹明-6-异硫氰酸、6-羧基-X-罗丹明琥珀酰亚胺酯、5-羧基-X-罗丹明琥珀酰亚胺酯、6-羧基-X-罗丹明、5-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯、6-羧基四甲基罗丹明、5-羧基四甲基罗丹明、6-羧基罗丹明6G、异硫氰酸荧光素、6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯、5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素、罗丹明B、罗丹明6G、7-氨基-4-甲基香豆素、Cy3或Cy5。
10.荧光标记的脂多糖抗体和荧光标记的脂磷壁酸抗体在制备细菌源性囊泡检测的试剂中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种检测细菌源性囊泡的方法，其特征在于：包括将待测囊泡样本溶液与荧光探针混合，恒温孵育，离心获得囊泡沉淀，用缓冲液将囊泡沉淀重悬；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：每107-109颗粒的待测囊泡对应添加4-6μg荧光探针。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述恒温孵育的温度为35-40℃；
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述离心的条件为2-8℃，95000-160000g离心35-70min；
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述生物颗粒检测平台为纳米流式检测仪；
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述荧光标记可重复的选自alexa fluor488、二氢罗丹明123、四甲基罗丹明-6-马来酰亚胺、四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺、5-吲哚乙酰氨基荧光素、6-羧基-2'4,7,7-四氯荧光素琥珀酰亚胺酯、双[nn-双(羧甲基)氢甲基]荧光素四钠盐、荧光素-5-马来酰亚胺、5-异硫氰酸荧光素尸胺、磺基罗丹明g、7-羟基-4-甲基香豆素、3-氰基-7-羟基香豆素、荧光素二钠盐fluorescein荧光素、6-荧光素氨基磷酸酯、四甲基罗丹明-6-异硫氰酸、6-羧基-x-罗丹明琥珀酰亚胺酯、5-羧基-x-罗丹明琥珀酰亚胺酯、6-羧基-x-罗丹明、5-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯、6-羧基四甲基罗丹明、5-羧基四甲基罗丹明、6-羧基罗丹明6g、异硫氰酸荧光素、6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯、5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯、5-羧基荧光素、6-羧...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑磊，司徒博，欧子豪，李迁贝，
申请(专利权)人：南方医科大学南方医院，
类型：发明
国别省市：
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