【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物组织培养领域，具体涉及一种芦竹松散型胚性愈伤组织的诱导方法。
技术介绍
1、芦竹(arundo donax)为禾本科芦竹属多年生大型草本植物，丰产期高达10m，根状茎发达。芦竹适应环境能力强，生长速度快，常被作为造纸和景观用材。20世纪以来，在能源紧张和环保意识日益受到关注的背景下，欧洲国家研究筛选了20种多年生草本植物，其中芦竹被认为是最具能源植物潜力的多年生牧草物种。近年来，根据芦竹的生物学特性，其在恢复土壤退化、修复湿地重金属污染以及作为新型生物质能源的特性得到了研究，其利用价值和开发潜力也越来越受到人们的重视。
2、芦竹为无性繁殖，种子不育，一般杂交育种十分困难，采用诱变育种和基因转化育种是丰富其种质资源的最好方法。鉴于转基因植物的环境释放问题，目前最可行的方法是通过体细胞离体诱变育种，而用于诱变的材料最理想的就是胚性愈伤组织。
3、植物细胞经过脱分化诱导可以转变成具有薄壁细胞特征的愈伤组织细胞，这类细胞一般稳定性较差，在一定条件下很容易转变成其它类型的细胞，其中可以转变为具有胚性特征的愈伤组织细胞。这类胚性愈伤组织细胞可以很容易通过胚性发生的途径分化成胚状体，并在适当条件下再生出完整的植株。以上这种愈伤组织通过脱分化、再分化，并通过胚性发生途径的再生方式是植物细胞工程上经常需要用到的。胚性愈伤组织细胞主要应用于植物材料保存、繁殖和遗传转化和体细胞离体诱变育种等方向，也可以用于植物分子遗传机理、细胞生物学等基础研究。因此，在生产与研究中会经常遇到植物胚性愈伤组织诱导的问题。>
4、愈伤组织诱导时，诱导条件会导致愈伤组织的质地与结构出现不同的变化，有的结构紧密，有的结构松散，这主要取决于组成愈伤组织团的细胞链接的特点，当愈伤组织细胞彼此链接紧密时，愈伤组织团就会出现紧密的现象，相反，则会表现出结构松散的类型。
5、在通常情况下，植物愈伤组织离体诱导后，进一步诱导其胚性化，最终达到愈伤组织胚性发生的目标。但芦竹松散型的愈伤组织在进行松散型胚性愈伤组织诱导时，常会出现愈伤组织褐变死亡，胚性化几率极低甚至不出现胚性化。因此，能够建立一套高效的胚性愈伤组织诱导体系对于芦竹的种质资源创新和新品种培育有着重要的意义。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是建立一套芦竹松散型胚性愈伤组织诱导体系，为芦竹诱变育种、组织脱毒和组培快繁提供理想的试材。
2、为实现本专利技术的目的所采用的技术方案是：
3、一种芦竹松散型胚性愈伤组织的诱导方法，主要包括以下步骤：
4、(1)芦竹愈伤组织初步诱导
5、利用芦竹组培苗的外植体在培养基上诱导愈伤组织，室温避光培养，期间不需要继代培养。
6、其中，所述芦竹组培苗的竹茎、枝条及根部均可以作为外植体，作为优选，优选所述芦竹组培苗的根部为外植体；
7、所述培养基为：1/2ms+2-3mg/l2，4-d+15g/l蔗糖的培养基；
8、培养条件为：培养温度24-26℃，避光培养，培养时间是30d，期间不需要继代培养。
9、诱导出的愈伤组织为质地很软的状态，一般不需要解剖刀切割，用镊子从外植体上夹取分离；
10、(2)芦竹松散型愈伤组织诱导
11、将步骤(1)诱导出的愈伤组织从芦竹外植体上切下，将其转接到培养基上诱导松散型愈伤组织。培养条件是：室温连续光照继代培养若干次；
12、本步骤所用的所述培养基为ms+1-2mg/l6-ba+1-2mg/l2，4-d+30g/l蔗糖的培养基；
13、进一步，继代时注意观察愈伤组织的状态，芦竹松散型愈伤组织的状态特征为：愈伤组织团由颗粒状的细小的愈伤组织组成，极易分散，同时转接时可以感觉到其质地较硬，与初步诱导出的松软型愈伤组织不同。在每次继代培养时将变成褐色的愈伤组织团舍弃，选择质地较硬，颜色为白色的愈伤组织团进行继代培养，当愈伤组织达到上述描述的状态时即可停止培养；
14、进一步，培养条件是：培养温度24-26℃，连续光照培养，光照强度为500-1000lux。此步骤需要继代培养2-3次。
15、(3)芦竹松散型胚性愈伤组织的诱导
16、将步骤(2)诱导出的所述芦竹松散型愈伤组织转移到培养基上，所述培养基中加入蔗糖，将接种后的培养瓶放置到温度为7-20℃的恒温培养箱中进行培养，避光培养；作为优选，优选温度为10-15℃。
17、进一步，上述过程中所述培养基为ms+0.2-0.5mg/l6-ba，在所述培养基中加入40g蔗糖，培养时间为3d；
18、然后将所述培养瓶转移到温度为15-25℃的恒温培养箱中继续培养，作为优选，培养时间为7d，培养温度为20℃；
19、培养结束后，将所述培养瓶中的愈伤组织转接到新的蔗糖的培养基上继续培养；
20、进一步，上述过程新的培养基为ms+0.2-0.5mg/l6-ba+0.35-0.5mg/l2，4-d+30g/l蔗糖的培养基，作为优选，优选培养基为ms+0.5mg/l6-ba+0.5mg/l2，4-d+30g/l蔗糖的培养基，培养条件：培养温度24-26℃，连续光照培养，光照强度为500-1000lux，继代培养3-5，经过3-5次继代培养就可以获得理想的芦竹松散型胚性愈伤组织；
21、对松散型胚性愈伤组织的鉴别方法如下：取待检的愈伤组织团放到载玻片上，滴1滴醋酸洋红染色剂，2-3分钟后盖上盖玻片进行压片，使得所述愈伤组织细胞分散开，在显微镜下进行观察，当观察到的所述芦竹愈伤组织细胞中超过70-80％的细胞核与细胞直径的比值达到0.3-0.4之间，观察到的所述细胞中处于有丝分裂期的细胞占比达到1％以上时，就可以判定诱导出的所述愈伤组织达到了完全胚性化，同时所述愈伤组织的形态仍然处于松散型；
22、(4)芦竹松散型胚性愈伤组织保持培养
23、将步骤(3)诱导出的所述芦竹松散型胚性愈伤组织转接到蔗糖培养基上培养；
24、进一步，上述步骤所述的所述蔗糖培养基为ms+0.1-0.2mg/l6-ba+0.3-0.5mg/l2，4-d+30g/l蔗糖的培养基；
25、培养条件为：培养温度22-23℃，连续光照培养，光照强度为500-1000lux，继代时间为20d，经过多次继代培养，愈伤组织的胚性可以保持180d以上；
26、通过显微观察愈伤组织的胚性情况，继代时将外形不符合松散型愈伤组织和变色的愈伤组织舍弃。
27、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
28、仅通过改变培养基并不能诱导出芦竹松散型胚性愈伤组织，仅调整温度，温度不与培养基配合，也并不能诱导出芦竹松散型胚性愈伤组织，本申请芦竹松散型愈伤组织诱导后，转接到特定培养基ms+0.2-0.5mg/l6-ba上培养，结束后继续培养，采用低温胁迫方式结合激素诱导的方法对松散型愈伤组织进行松散型胚性愈伤组织诱导，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种芦竹松散型胚性愈伤组织的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种芦竹松散型胚性愈伤组织的诱导方法，其特征在于：步骤(3)中将接种后的培养瓶放置到温度为10-15℃的恒温培养箱中避光培养；
3.根据权利要求1或2所述的一种芦竹松散型胚性愈伤组织的诱导方法，其特征在于：
4.根据权利要求3所述的一种芦竹松散型胚性愈伤组织的诱导方法，其特征在于：
5.根据权利要求1-4所述的一种芦竹松散型胚性愈伤组织的诱导方法，其特征在于：
6.根据权利要求1-5任一项所述的一种芦竹松散型胚性愈伤组织的诱导方法，其特征在于，
7.根据权利要求1-6任一项所述的一种芦竹松散型胚性愈伤组织的诱导方法，其特征在于：所述芦竹组培苗的根部作为外植体。
8.根据权利要求1-7任一项所述的一种芦竹松散型胚性愈伤组织的诱导方法，其特征在于：
9.根据权利要求8所述的一种芦竹松散型胚性愈伤组织的诱导方法，其特征在于：继代培养次数为2-3次。
10.一种芦竹松散型胚性愈伤组织的鉴别
...【技术特征摘要】
1.一种芦竹松散型胚性愈伤组织的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种芦竹松散型胚性愈伤组织的诱导方法，其特征在于：步骤(3)中将接种后的培养瓶放置到温度为10-15℃的恒温培养箱中避光培养；
3.根据权利要求1或2所述的一种芦竹松散型胚性愈伤组织的诱导方法，其特征在于：
4.根据权利要求3所述的一种芦竹松散型胚性愈伤组织的诱导方法，其特征在于：
5.根据权利要求1-4所述的一种芦竹松散型胚性愈伤组织的诱导方法，其特征在于：
6.根据权利要求1-5任一项所述的一种芦竹松散型胚性愈伤组织的诱导方法，其特征在于，
7.根据权利要求1-6任一项所述的一种芦竹松散型胚性愈伤组织的诱导方法，其特征在于：所述芦竹组培苗的根部作为外植体。
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【专利技术属性】
技术研发人员：王硕，刘艳军，许莹楠，裴毅，岳露，张强，王广卫，
申请(专利权)人：天津市德宇生物工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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