【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及ompw，具体涉及鲍曼不动杆菌多抗原表位肽rompw及其应用
技术介绍
1、鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii,a.b)广泛存在于自然界，是一种严格需氧的革兰阴性杆菌[1]。a.b能够导致肺炎、败血症、脑膜炎、创伤后感染和尿道感染等，是医院感染的重要条件致病菌[2-4]。鲍曼不动杆菌是一种严格需氧的革兰阴性杆菌，对湿热、紫外线及化学消毒剂有较强的抵抗力[1]。作为一种eskape致病菌，a.b能够导致肺炎、败血症、脑膜炎、创伤后感染和尿道感染等[2-4]。由于抗生素的选择压力，多耐药及泛耐药的a.b逐渐增多，这对人类健康产生巨大的威胁[5-7,13]。a.b耐药机制复杂，对临床常用的抗生素均可产生耐药。替加环素和多粘菌素被认为是治疗耐药革兰阴性杆菌的最后一道防线，但是近期对替加环素和多粘菌素耐药的菌株在全球范围内出现并广泛流行[5,7,14]。新的抗菌药物研制时间长，也容易诱导a.b产生新的耐药。疫苗是有效预防和控制a.b感染的一种方式，研发针对a.b的疫苗成为许多专利技术者关注的热点[15,16]。
2、专利技术人在cn 110950939b公开了鲍曼不动杆菌omp22重组多抗原表位多肽，尽管该疫苗具有良好的治疗效果，但仍然需要专利技术更多的针对不同表位的疫苗，提高疗效、减少耐药性或副作用等。
3、ompw是a.b一种重要的外膜蛋白，与细菌的黏附、侵袭相关，并在调节细菌铁稳态中发挥重要的作用[10,11]。ompw具有高度保守性和免疫原性。有专利技术发现，在a.b
4、为减少或消除ompw蛋白的毒性，并保留其免疫原性，可以将ompw蛋白中具有免疫保护效应的结构筛选出来，但ompw蛋白中发挥免疫效应的结构尚不明确，故难以进行后续疫苗专利技术
技术实现思路
1、专利技术目的
2、本专利技术运用生物信息学方法，对ompw蛋白抗原的t细胞表位和b细胞表位进行预测和筛选，在小鼠体内进行了免疫验证，化学合优势表位，发现ompw蛋白中发挥免疫效应的结构，并构建了多表位多肽rompw，并验证其安全性及有效性。
3、技术方案
4、鲍曼不动杆菌多抗原表位多肽rompw，其特征在于：其氨基酸序列为：eqgvadkvkedfg x akyhfknstrftpy x psedtttalgvvkad；其中x为6-氨基己酸。
5、所述的鲍曼不动杆菌多抗原表位肽rompw在制备鲍曼不动杆菌亚单位疫苗中的应用。
6、有益效果
7、1、本专利技术构建了多表位多肽rompw，该多肽为全新多肽，未见文献报道，属于首次发现。具体如下：
8、本专利技术成功构建并表达并纯化得到ompw全长蛋白。通过生物信息学方法预测ompw蛋白6条b细胞表位和4条t细胞表位，化学合成法构建相应肽段，免疫学方法筛选出2条优势b细胞表位和1条优势t细胞表位。通过6-氨基己酸将2条优势b细胞表位和1条优势t细胞表位进行串联，化学合成法构建了多表位多肽rompw，该多肽为全新多肽，未见文献报道，属于首次发现。.体内外验证rompw无毒性，可用于体内实验。初步验证rompw对ab急性感染小鼠模型有免疫保护作用，且初步筛选出rompw的有效剂量，rompw为50ug，为后续实验奠定基础。
9、具体结果如下：
10、(1)经酶切鉴定及测序鉴定证实重组质粒pet28a-ompw构建成功，诱导表达ompw全长蛋白，sds-page结果显示，ompw蛋白分子量约23kda，与理论值相符；
11、(2)通过生物信息学方法预测了ompw蛋白的6条b细胞表位(ompw b1、b2、b3、b4、b5及b6)和4条t细胞表位(ompw t1、t2、t3及t4)，并化学合成了各表位肽段；末次免疫一周后，间接elisa法检测小鼠血清中特异性igg抗体结果显示：ompw b1和ompw b6能够与ompw全长蛋白免疫小鼠的血清发生抗原抗体反应，其od450 nm值分别为1.81±0.55及1.39±0.38，显著高于pbs免疫组小鼠(分别为0.23±0.05及0.34±0.15)(p<0.001)，故确定其为ompw蛋白有效的b细胞表位；继而以4条t细胞表位肽段刺激脾细胞，其中t4肽段刺激ompw蛋白免疫组小鼠脾细胞分泌的ifn-γ为27.06±7.69pg/ml，显著高于pbs免疫组(4.04±1.26)(p<0.001)，而ompw t1、t2和t3肽段刺激两组脾细胞产生的ifn-γ无显著差异，确定ompwt4为ompw蛋白的优势t细胞表位。
12、(3)将ompw蛋白的2条优势b细胞表位(b1及b6)和1条优势t细胞表位(t4)肽段进行串联，用6-氨基己酸连接，以化学合成法构建多表位多肽rompw，其氨基酸数量为45个、分子量为4974.60da，经hplc法鉴定其纯度为95.50％；
13、(4)体外安全性评估：在不同浓度及不同时间，rompw对a549细胞无抑制作用，在24h及48h时，ompw在浓度为20μg/ml对a549细胞生长即有明显抑制作用；
14、(5)体内安全性评估：ompw小鼠血清中bun水平为8.42±0.48μmol/l显著增加对照组4.46±0.087μmol/l(p＜0.001)，而ompw组小鼠血清中alt、ast及cre与对照组相比无显著性差异，不同浓度rompw对小鼠血清中alt、ast、bun及cre亦无显著性差异(p均＞0.05)，心脏、肾、肝、脾和肺的组织he染色显示：不同浓度rompw及ompw组小鼠无明显的损伤；
15、(6)末次免疫一周后，采集小鼠外周血检测血清中rompw特异性igg水平，ompw组及rompw(25μg、50μg及100μg)组od450分别为1.28±0.20、1.19±0.12、2.85±1.20及2.79±1.04，显著高于对照组(0.19±0.03)(p＜0.001)，rompw 50μg及100μg组显著高于ompw及rompw 25μg组(p＜0.01)；
16、(7)ab标准株(atcc19606)攻击balb/c小鼠24h后外周血菌落计数，ompw、rompw(25μg、50μg及100μg)组(lgcfu/ml)分别为3.38±0.31、3.19±0.26、1.73±0.02及1.70±0.01，显著低于对照组(8.23±0.53)(p<0.001)，其中rompw 50μg及rompw 100μg组(lgcfu/ml)显著低于ompw组及rompw 25μg(p<0.01)；右肺组织菌落计数，ompw组及rompw(25μg、50μg及100μg)组(lgcfu/ml)分别为7.99±0.04、7.37±0.51、7本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.鲍曼不动杆菌多抗原表位肽rOmpW，其特征在于：其氨基酸序列为：
2.根据权利要求1所述的鲍曼不动杆菌多抗原表位肽rOmpW在制备鲍曼不动杆菌亚单位疫苗中的应用。
【技术特征摘要】
1.鲍曼不动杆菌多抗原表位肽rompw，其特征在于：其氨基酸序列为：
2.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：杜兴冉，朱成华，张秀伟，杨宁，万兵，蔡伟，杨旸，晋发，文昱婷，
申请(专利权)人：南京市江宁医院，
类型：发明
国别省市：
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