【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，尤其涉及一种基于甲醇同化高产d-泛酸的基因工程菌、构建方法及应用。
技术介绍
1、d-泛酸又称维生素b5，化学分子式c9h17no5，相对分子量219.24，是一种重要的水溶性维生素。d-泛酸及其衍生物在食品、医药、饲料、化妆品等领域有广泛的应用。在食品领域，d-泛酸可作为一种食品营养强化剂可用于多种食品添加以补充营养成分；在医药方面，d-泛酸作为人体必需的维生素普遍存在于生物体内，其衍生物d-泛酸钙的单方制剂可用于治疗d-泛酸缺乏症，与其他组分构成的复方制剂可用于治疗神经炎、神经衰弱、术后肠绞痛和呼吸道等疾病，同时也可用于多种保健食品等；在饲料方面，饲料中添加一定剂量的d-泛酸能满足猪、鸡和鱼类等生长发育、脂肪代谢的需求，避免出现生长迟缓、适应性及抗病性下降、生殖系统障碍、毛发脱落的现象；在化妆品方面，d-泛酸及其衍生物d-泛醇与皮肤、毛发的营养状态息息相关，可用于防治毛发干枯和损伤，提高毛发营养使其光线亮泽。并且有增加保湿和抗老化的作用，促进皮肤对营养成分的吸收，广泛应用与保湿霜、护发液和乳液等化妆品。
2、目前生产d-泛酸的方法主要有三种：化学合成法，酶催化法和发酵合成法。
3、化学合成法，先通过化学法制备得到前体物β-丙氨酸和d,l-泛解酸内酯，再合成d-泛酸。其中的β-丙氨酸主要通过丙烯腈法、丙烯酸法和琥珀酸亚胺法合成得到，而d,l-泛解酸内酯主要通过异丁醛-甲醛法、异丁醛-醛乙酸法和异丁醛-三氯甲烷法制备得到，但是化学法高耗能、对设备损耗大，同时产生对人体和环境的有害物
4、酶法合成d-泛酸，利用微生物来源的泛酸合成酶，以d-泛解酸和β-丙氨酸为底物完成d-泛酸的合成，但是其前体物d-泛解酸和β-丙氨酸仍需要化学合成得到。
5、发酵法合成d-泛酸，是利用基因编辑手段对工程菌进行代谢改造发酵生产d-泛酸。利用生物发酵法生产d-泛酸产品，可以利用葡萄糖等廉价的工业原料、经过生物体自身代谢反应而得到d-泛酸产品，通过合理运用微生物来生产d-泛酸，不仅能够保证泛酸的拆分质量而且还能降低反应成本。相较化学法，生物法具有更加绿色环保的优点。但生物发酵法存在发酵过程不稳定、产量不高等问题。
6、甲醇同化是一种微生物代谢过程，指的是微生物利用甲醇作为碳源进行生长和能量代谢的过程。在甲醇同化中，甲醇被微生物利用，并通过一系列的代谢途径转化为有机物，以满足细胞的能量和碳源需求。甲醇是结构最简单的饱和一元醇，是化学物质大规模生物生产的应用广泛的底物，它比碳水化合物含有更多的能量和电子。我国的甲醇产能处于国际领先地位，呈现出过剩趋势，甲醇的经济发展急需配套的甲醇转化利用技术。然而，到目前为止，在工程化天然甲基营养菌以高速率和高浓度生产生物基产物方面仅取得有限的成功。
技术实现思路
1、为了解决上述生物发酵合成d-泛酸产量不高的技术问题，本专利技术提供了一种基于甲醇同化高产d-泛酸的基因工程菌、构建方法及应用。
2、本专利技术的具体技术方案为：
3、一方面，本专利技术提供了一种基于甲醇同化高产d-泛酸的基因工程菌，其构建方法包括以下步骤：强化底盘菌的甲醇同化途径。
4、微生物代谢中，甲醇同化途径是指将甲醇被消耗的过程，在本专利技术中，即将甲醇转化为甲醛的过程。甲醇脱氢酶、甲醇氧化酶是甲醇同化途径中的关键酶，本专利技术利用基因工程的相关技术，对底盘菌甲醇同化途径基因组进行编辑，强化底盘菌的甲醇同化途径，使得底盘菌发酵生产d-泛酸的产量得以提高，构建得到一种高产d-泛酸的基因工程菌。
5、作为本专利技术上述技术方案的优选，所述底盘菌为escherichia coli w3110trc-pancpanepanbilvc/ilvga/δavta/ilveb/coaacδilvatrc-lpdδglk/ilva*；其中，a表示ilvg基因的976-979碱基突变成atc，恢复ilvg基因的正常表达；b表示ilve基因的起始密码子atg突变成gtg；c表示coaa基因的316-318位cgt碱基突变为gct，*表示回补ilva基因。
6、作为本专利技术上述技术方案的优选，强化底盘菌的甲醇同化途径的方法包括以下步骤：通过在底盘菌基因组中引入以下任意一段基因或任意两段及以上基因得到：mdh基因、aox1基因、aox2基因。
7、mdh基因、aox1基因、aox2基因是甲醇同化途径中关键酶的编码基因，其中，mdh基因为编码甲醇脱氢酶的基因，aox1基因、aox2基因为编码甲醇氧化酶的基因。本专利技术通过多次实验验证，在底盘菌中引入mdh基因、aox1基因、aox2基因，强化底盘菌的甲醇同化途径，可以提高底盘菌发酵生产d-泛酸的产量。
8、另一方面，本专利技术给出了上述基于甲醇同化高产d-泛酸的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
9、步骤s1：敲除底盘菌基因组中的frma基因；
10、步骤s2：在底盘菌基因组中插入以下任意一段基因或任意两段及以上基因：mdh基因、aox1基因、aox2基因。
11、本专利技术通过步骤s1～步骤s2，构建得到了一种高产d-泛酸的基因工程菌。本专利技术在实验中发现，通过在底盘菌基因组中插入mdh基因、aox1基因或aox2基因，强化底盘菌甲醇同化途径，可以使得底盘菌发酵生产d-泛酸的产量得以提高。进一步分析及验证其原理，后来发现，在底盘菌基因组中插入mdh基因、aox1基因或aox2基因后，可以使得菌株在发酵生产的过程中甲醛的积累增加，且甲醛的积累量与d-泛酸的产量具有正相关的规律性，即在全细胞催化甲醇转化实验中，使得甲醛积累量越多的菌株，在发酵生产d-泛酸的过程中，该菌株的d-泛酸产量越高。因此，进一步推测，提高菌株的甲醛积累量，对于提高d-泛酸产量有重要意义。步骤s1中，frma基因是甲醛脱氢酶编码基因，通过敲除底盘菌的frma基因，可以抑制底盘菌的甲醛消耗途径，进而进一步提高底盘菌发酵生产d-泛酸的产量。
12、作为本专利技术上述技术方案的优选，所述底盘菌为escherichia coli w3110trc-pancpanepanbilvc/ilvga/δavta/ilveb/coaacδilvatrc本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于甲醇同化高产D-泛酸的基因工程菌，其特征在于：其构建方法包括以下步骤：强化底盘菌的甲醇同化途径。
2.如权利要求1所述的一种基于甲醇同化高产D-泛酸的基因工程菌，其特征在于：所述底盘菌为Escherichia coli W3110
3.如权利要求1所述的一种基于甲醇同化高产D-泛酸的基因工程菌，其特征在于：强化底盘菌的甲醇同化途径的方法包括以下步骤：
4.如权利要求1～3任一项所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述底盘菌为Escherichia coliW3110Trc-panCpanEpanBilvC/ilvGa/ΔavtA/ilvEb/coaAcΔilvATrc-lpdΔglk/ilvA*；其中，a表示ilvG基因的976-979碱基突变成ATC，恢复ilvG基因的正常表达；b表示ilvE基因的起始密码子ATG突变成GTG；c表示coaA基因的316-318位CGT碱基突变为GCT，*表示回补ilvA基因。
6.如权利要求4所述的构建方法，
7.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于：AOX1基因来源于毕赤酵母、假丝酵母、汉逊酵母。
8.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于：AOX2基因来源于毕赤酵母、假丝酵母、汉逊酵母。
9.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于：Mdh基因核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，AOX1基因核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，AOX2基因核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
10.如权利要求1～3任一项所述的基因工程菌或权利要求4～9任一项所述的构建方法构建得到的基因工程菌在生产D-泛酸中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基于甲醇同化高产d-泛酸的基因工程菌，其特征在于：其构建方法包括以下步骤：强化底盘菌的甲醇同化途径。
2.如权利要求1所述的一种基于甲醇同化高产d-泛酸的基因工程菌，其特征在于：所述底盘菌为escherichia coli w3110
3.如权利要求1所述的一种基于甲醇同化高产d-泛酸的基因工程菌，其特征在于：强化底盘菌的甲醇同化途径的方法包括以下步骤：
4.如权利要求1～3任一项所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述底盘菌为escherichia coliw3110trc-pancpanepanbilvc/ilvga/δavta/ilveb/coaacδilvatrc-lpdδglk/ilva*；其中，a表示ilvg基因的976-979碱基突变成atc，恢复ilvg基因的正常表达；b表...
【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，冯雪云，周俊平，张博，黄良刚，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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