一种大片段DNA跨物种转移辅助菌株的构建方法及应用技术

本发明专利技术属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种大片段DNA跨物种转移辅助菌株的构建方法及应用。所述构建方法包括：将出发菌株大肠杆菌的DNA甲基化系统进行敲除，获得大肠杆菌DNA甲基化系统缺失突变株；改造接合转移辅助质粒pUZ8002，将质粒自带的卡那霉素抗性基因和四环素抗性基因进行敲除，并添加氨苄青霉素抗性基因，便于抗性筛选；将改造后的接合转移辅助质粒导入大肠杆菌DNA甲基化系统缺失突变株，经筛选获得正确的转化子，向其中导入Red/ET同源重组辅助质粒pSC101‑ccdA‑gbaA即得。本发明专利技术构建的大片段DNA跨物种转移辅助菌株在细胞工厂和人工生命体构建方面具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程和微生物，具体涉及一种大片段dna跨物种转移辅助菌株的构建方法及应用。

技术介绍

1、本专利技术
技术介绍
中公开的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、对生命体基因组进行改造经常需要导入大片段外源dna。例如，微生物次级代谢产物及其衍生物具有广泛的生物活性，如抗感染、抗肿瘤、免疫抑制、降血糖等，它们被广泛地用于医药、农业、食品、环保等领域。由于大多数活性化合物的生物合成基因簇在原始菌株和实验室培养条件下不表达，将次级代谢产物的生物合成基因簇进行克隆修饰后导入异源底盘细胞中表达(即异源表达)是挖掘和改造活性次级代谢产物的重要策略。然而，次级代谢产物的生物合成基因簇通常长达几十kb甚至上百kb，通常需要借助大肠杆菌作为中间供体菌，通过接合转移的方式将基因簇导入合适的底盘宿主。许多底盘宿主，如链霉菌等，具有多重限制性修饰系统，能够切割被甲基化修饰的外源dna，成为限制外源dna导入的主要屏障之一。其中一种有效的解决途径是将待转移的d本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种大片段DNA跨物种转移辅助菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：将出发菌株大肠杆菌的DNA甲基化系统进行敲除，获得大肠杆菌DNA甲基化系统缺失突变株；改造接合转移辅助质粒pUZ8002，将质粒自带的卡那霉素抗性基因和四环素抗性基因进行敲除，并添加氨苄青霉素抗性基因，便于抗性筛选；将改造后的接合转移辅助质粒导入大肠杆菌DNA甲基化系统缺失突变株，经筛选获得正确的转化子，向其中导入Red/ET同源重组辅助质粒pSC101-ccdA-gbaA即得。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述出发菌株大肠杆菌具体为大肠杆菌GB2005。>

3.如权利要...

【技术特征摘要】

1.一种大片段dna跨物种转移辅助菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：将出发菌株大肠杆菌的dna甲基化系统进行敲除，获得大肠杆菌dna甲基化系统缺失突变株；改造接合转移辅助质粒puz8002，将质粒自带的卡那霉素抗性基因和四环素抗性基因进行敲除，并添加氨苄青霉素抗性基因，便于抗性筛选；将改造后的接合转移辅助质粒导入大肠杆菌dna甲基化系统缺失突变株，经筛选获得正确的转化子，向其中导入red/et同源重组辅助质粒psc101-ccda-gbaa即得。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述出发菌株大肠杆菌具体为大肠杆菌gb2005。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述将出发菌株大肠杆菌的dna甲基化系统进行敲除的具体方法包括：基于ccdb反向筛选技术敲除基因yhdj、dcm、muts和dam。

4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述改造接合转移辅助质粒puz8002的具体方法包括：将接合转移辅助质粒puz8002转入大肠杆菌gb05-red中，扩增出片段kan-ampr，其两端带有puz8002质粒上卡那霉素抗性基因kanr的同源臂和avrⅱ的酶切位点；将所述片段kan-ampr导入诱导表达重组酶的gb05-red::puz8002中，筛选ampr替换掉kanr的突变株gb05-red::puz8002-delkanr-ampr；提取质粒puz8002-delkanr-ampr并用限制性内切酶afeⅰ进行酶切验证，用限制性内切酶avrⅱ消化质粒puz8002-d...

【专利技术属性】
技术研发人员：颜富，韩丽媛，张友明，陆秋杰，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：