【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种用于检测血浆中tn含量的单克隆抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
1、败血症(脓毒症)是指由微生物感染引起的全身性炎症反应综合征，其死亡率高于25-30％；如果出现休克，死亡率甚至高达40-50％。目前尚无有效的特异性抗脓毒症治疗方法，因此对败血症患者的治疗主要依赖于早期识别，以便迅速采取正确的治疗措施，包括使用适当的抗生素，必要时采取源头控制措施、或使用静脉输液和血管活性药物进行复苏。目前临床上主要根据体温变化和血常规结果辅助诊断，或晚期血培养检测病原体等方法进行诊断。然而，血培养检测病原微生物至少需要72h才能出诊断结果，甚至有时连续培养两次未果仍无法判断病因，这对于败血症这种急性炎症疾病的确诊非常不利并延误了疾病的治疗。最新的研究发现，败血症或感染性休克患者的血浆中四连接素tn(tetranectin)与发病相关，其含量与正常人相比特异性地显著下降。因此如果能以此为败血症的免疫检测靶标可以实现临床上对败血症的快速诊断。
2、中国专利公开号为cn215866719u的专利公开了一种多指标快速检测新生儿败血症的荧光免疫层析试纸条，该技术专利涉及体外诊断
,具体涉及多指标快速检测新生儿败血症的荧光免疫层析试纸条。该技术专利采用的生物靶标是pct(降钙素原)、il-6(一种促炎细胞因子)、il-8(一种趋化因子)，对新生儿败血症的早期诊断提供了方法。荧光免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术。该技术以固定有检测线和质控线的条状纤维层析材料为固定相,测试液为流动相,
技术实现思路
1、败血症的死亡原因主要是由于患者肺部组织分泌的tn蛋白可与其肝脏组织分泌的hmgb1(高迁移率族蛋白b1)结合成复合物，被巨噬细胞吞噬后可触发后者产生细胞焦亡，从而导致机体免疫抑制，无法清除病原微生物。同时，患者血浆中的tn浓度与败血症的进程密切相关。研究统计发现，由于蛋白tn和hmgb1之间的相互作用，败血症或败血症休克患者的血浆tn浓度降低了62-67％，与败血症的发生密切相关。本专利技术以此为生物靶标运用杂交瘤技术制备tn的单克隆抗体，筛选出亲和力特异性最高的抗体应用于tn的免疫诊断研究中，建立一种高灵敏度低成本的可用于临床使用的快速败血症免疫检测方法。
2、相关技术术语的名词解释：
3、tn:tetranectin四连接素
4、p5-5：tn抗原肽
5、为实现本专利技术的目的，提供一下技术方案：
6、一种用于检测血浆中tn含量的单克隆抗体的制备方法，具体如下：
7、(1)tn完全抗原的制备
8、将载体蛋白bsa或ova溶解在偶联缓冲溶液中，同时将p5-5抗原肽(tn的关键抗原表位ndalyeylrq)溶解在偶联缓冲液中，在磁力搅拌下缓慢滴加edc溶液并置于25℃磁力搅拌反应后透析去除未偶联的多肽和edc试剂；
9、(2)动物免疫
10、用bca蛋白测定试剂盒测定tn完全抗原的浓度后，取适量的抗原与弗氏佐剂混匀乳化完全后进行皮下注射6～7周龄的balb/c雌性小鼠，进行多次免疫；
11、(3)抗血清采集与效价测定
12、从第四次免疫结束后，采用间接elisa方法测定小鼠的抗血清效价；
13、(4)细胞融合
14、在细胞融合之前准备好骨髓瘤细胞sp2/0和饲养细胞，并在超净工作台中制备好步骤(3)中达到融合需求抗血清效价的小鼠脾细胞悬液，将准备好的脾细胞悬液与sp2/0细胞悬液混在一起，倒出上清液；用移液枪把剩余的细胞沉淀搅拌混匀，并晃动离心管，待细胞完全散开后，将离心管置于37℃水浴中，在1min之内按照先慢后快的顺序滴加缓慢加入已预热的peg1450融合剂，一边滴加一边不断晃动离心管，滴加结束后静置；紧接着在1min内缓慢地加入1ml提前预热的1640不完全培养基，第2min加入3ml1640不完全培养基，第3min加入5ml1640不完全培养基，第4min加入10ml1640不完全培养基，直至终体积为50ml时终止细胞融合；随后将离心管放入细胞培养箱静置10min，室温离心，倒出上清液；往有细胞沉淀的离心管中加入事先配置的含有2％hat的完全培养基，吹散混匀后把离心管置于细胞培养箱；然后把离心管取出来，融合后的细胞按照每孔100μl加入之前已经铺入饲养细胞的96孔板，最后放入细胞培养箱培养；
15、(5)杂交瘤细胞亚克隆
16、采用有限稀释法对杂交瘤细胞进行亚克隆，取阳性孔的细胞吹散混匀，用移液枪吸取10μl加入到每孔含有300μl2％hat单抗专用培养基的96孔培养板中，不断进行纵向和横向梯度稀释，直到最后一列和最后一行在显微镜下观察到每孔中只剩一个细胞为止；然后将细胞培养板转移至培养箱中培养，待单细胞集落孔长满培养板孔径的60％～80％时取出100μl杂交瘤细胞培养上清做elisa检测，若od450nm大于0.8则为阳性，取阳性孔只有单一集落的杂交瘤细胞继续吹散克隆化筛选；
17、(6)单克隆抗体亚型鉴定
18、tn抗原包被封闭洗板后，每孔加入杂交瘤细胞培养上清，37℃反应1h，洗净甩干，然后加入相应的抗体亚型试剂，37℃反应1h，洗净甩干，每孔加入tmb显色液37℃反应30min，最后加入2mh2so4终止反应，用酶标仪检测od450nm的吸光值；
19、(7)腹水制备与单克隆抗体纯化
20、选取10～11周龄的雌性balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射腹水专用佐剂致敏；致敏后两周，选取6孔细胞培养板中的生长状态良好的杂交瘤细胞进行细胞计数后注射到致敏的小鼠腹腔；10～12d后即可采用无菌针头扎入小鼠的下部腹腔收集腹水，腹水收集完毕后离心10min；离心后的腹水取中间相进行单克隆抗体层纯化。
21、进一步地，所述步骤(1)中，将两种溶液混合后载体蛋白与多肽的摩尔比为1:10。
22、进一步地，所述步骤(2)中，免疫时选择小鼠的腹部或者背部进行皮下多点注射，每次免疫的时间为15d，待5～6次免疫后即可开始测定抗血清的效价。
23、进一步地，所述步骤(3)中，采用尾尖静脉采血的方式采血后收集于ep管中离心后可得抗血清，抗血清效价的测定采用间接elisa方法检测，具体方法如下：
24、①包被：用碳酸盐缓冲溶液稀释tn完全抗原加入96孔酶标板中，4℃过夜；
25、②封闭：将酶标孔内包被溶液全部去除，每孔加入含有5％脱脂牛奶的1×pbs溶液，37℃反应2h；
26、③洗板：将酶标孔内封闭溶液全部去除，每孔300μl1×pbs溶液，每次清洗2～3min，去除本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测血浆中TN含量的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，具体如下：
2.根据权利要求1所述用于检测血浆中TN含量的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，将两种溶液混合后载体蛋白与多肽的摩尔比为1:10。
3.根据权利要求1所述用于检测血浆中TN含量的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，免疫时选择小鼠的腹部或者背部进行皮下多点注射，每次免疫的时间为15d，待5～6次免疫后即可开始测定抗血清的效价。
4.根据权利要求1所述用于检测血浆中TN含量的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，采用尾尖静脉采血的方式采血后收集于EP管中离心后可得抗血清，抗血清效价的测定采用间接ELISA方法检测，具体方法如下：
5.根据权利要求1所述用于检测血浆中TN含量的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(7)中，单克隆抗体的纯化采用ProteinG Resin亲和层析进行纯化即可得到高纯度的单克隆抗体。
6.一种单克隆抗体，其特征在于，其采用权利要求1-5中任一项所述方法制备。
<...【技术特征摘要】
1.一种用于检测血浆中tn含量的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，具体如下：
2.根据权利要求1所述用于检测血浆中tn含量的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，将两种溶液混合后载体蛋白与多肽的摩尔比为1:10。
3.根据权利要求1所述用于检测血浆中tn含量的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，免疫时选择小鼠的腹部或者背部进行皮下多点注射，每次免疫的时间为15d，待5～6次免疫后即可开始测定抗血清的效价。
4.根据权利要求1所述用于检测血浆中tn含量的单克隆抗体的制备方法，其特征...
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