【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、细胞外囊泡由各种各样的细胞类型分泌。一般来说，细胞外囊泡(例如，外泌体、微囊泡和凋亡小体)是膜结合的，并且可以负载治疗性货物。外泌体是由大多数真核细胞分泌的一种类型的细胞外囊泡。当内体内陷夹入多泡体，形成腔内囊泡时，外泌体生物发生可能开始。如果多泡体与细胞的质膜融合，则腔内囊泡可以作为外泌体而释放。微囊泡是从细胞表面膜向外出芽的另一种类型的细胞外囊泡。另一方面，凋亡小体是由死亡细胞碎片形成的细胞外囊泡。
2、细胞外基质(ecm)为许多不同类型的组织提供结构支持，并且还影响体内的某些细胞过程。皮肤中ecm的组分包括胶原、弹性纤维、蛋白聚糖和糖胺聚糖。ecm的蛋白质的年龄相关的变化可能具有许多不同的后果。皱纹和弹性降低是皮肤老化的典型现象，并且很可能是真皮中细胞外基质(ecm)(例如，胶原)的量逐渐减少的结果。老化皮肤中胶原的减少可能归因于胶原产生的减少和/或胶原降解的增加。胶原和其他ecm蛋白质的结构变化还可能涉及真皮老化。
3、血管内皮生长因子(vegf)是一种促进血管生成(新血管生长)的信号传导蛋白。当细胞和组织由于血液循环受损而失去含氧血液时，vegf形成恢复向细胞和组织的血液供应的机制的一部分。
技术实现思路
1、在一些方面，本文描述多个细胞外囊泡，其包含外源性细胞外基质信使rna(mrna)。在一些情况下，外源性细胞外基质mrna编码胶原。在一些情况下，胶原选自：i型胶原、ii型胶原、iii型胶原、iv型胶原、v型胶原、vi型胶原、v
2、在一些情况下，多个细胞外囊泡包含平均每450个ev至少一个外源性细胞外基质mrna的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含平均每200个ev至少一个外源性细胞外基质mrna的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含平均每约0.1至100个ev至少一个外源性细胞外基质mrna的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含平均每2000个ev、每1000个ev、每500个ev、每400个ev、每300个ev、每200个ev、每150个ev、每100个ev、每90个ev、每80个ev、每70个ev、60个ev、50个ev、每40个ev、每30个ev、每20个ev、每15个ev、每10个ev、每5个ev、每2个ev或每1个ev至少一个外源性细胞外基质mrna的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含平均每个ev至少1、2、5、10、50、100、200、300、500或1000个外源性细胞外基质mrna的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含平均每个ev约1至10个外源性细胞外基质mrna的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含平均每个ev约1个外源性细胞外基质mrna的拷贝。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含平均每30个ev至少一个外源性细胞外基质mrna的拷贝。
3、在一些情况下，多个细胞外囊泡通过用编码细胞外基质蛋白的质粒转染细胞来产生。在一些情况下，细胞的转染是通过细胞纳米穿孔进行的。在一些情况下，细胞的转染是通过电穿孔进行的。在一些情况下，细胞为人细胞。在一些情况下，细胞为选自以下的成纤维细胞：真皮成纤维细胞、人成纤维细胞、成体成纤维细胞、人成体成纤维细胞、新生儿成纤维细胞、人新生儿成纤维细胞和人新生儿真皮成纤维细胞。在一些情况下，细胞为贴壁细胞。在一些情况下，细胞为人真皮成纤维细胞(例如，人新生儿真皮成纤维细胞)。
4、在一些情况下，多个细胞外囊泡包括选自以下的细胞外囊泡：外泌体、微囊泡、凋亡小体及其任何组合。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少一个外泌体。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含至少一个凋亡小体。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含至少一个微囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括以下中的至少任何两个的混合物：外泌体、微囊泡或凋亡小体。
5、在一些情况下，多个细胞外囊泡被配制用于经由静脉内途径、肌内途径、皮下途径或其任何组合来注射。在一些情况下，制剂包含一种或多种稳定剂和/或一种或多种防腐剂。在一些情况下，制剂包含一种或多种dna酶和/或rna酶抑制剂。在一些情况下，制剂包含一种或多种dna酶、dna酶抑制剂、rna酶和/或rna酶抑制剂。
6、在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少1x1013个细胞外囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少1x1014个细胞外囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少1x109个细胞外囊泡并且至多1x1020个细胞外囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至多1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x101、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包括至少1x106个细胞外囊泡并且至多1x1030个细胞外囊泡。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含至少1ng、10ng、20ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg细胞外基质mrna。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含至多1ng、10ng、20ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg细胞外基质mrna。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含至少1ng并且至多20μg细胞外基质mrna。在一些情况下，多个细胞外囊泡包含至少5ng并且至多30μg细胞外基质mrna。
7、在一些情况下，多个细胞外囊泡包括包含靶向多肽的细胞外囊泡。在一些情况下，靶向多肽靶向真皮细胞。在一些情况下，靶向多肽靶向氨肽酶n、cd26/dpp4、成纤维细胞激活蛋白α或其任何组合。在一些情况下，多个细胞外囊泡不包含以下mirna中的一种或多种：hsa-mir-29c-3p、hsa-m本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.多个细胞外囊泡，其包含外源性细胞外基质信使RNA(mRNA)。
2.如权利要求1所述的多个细胞外囊泡，其中所述外源性细胞外基质mRNA编码胶原。
3.如权利要求2所述的多个细胞外囊泡，其中所述胶原选自：I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原、V型胶原、VI型胶原、VII型胶原、VIII型胶原、IX型胶原、X型胶原、XI型胶原、XII型胶原、XIII型胶原、XIV型胶原、XV型胶原、XVI型胶原、XVII型胶原、XVIII型胶原、XIX型胶原、XX型胶原、XXI型胶原、XXII型胶原、XXIII型胶原、XXIV型胶原、XXV型胶原、XXVI型胶原、XXVII型胶原、XXVIII型胶原或其任何组合。
4.如权利要求2所述的多个细胞外囊泡，其中所述胶原为I型胶原。
5.如权利要求2所述的多个细胞外囊泡，其中所述胶原为II型胶原。
6.如权利要求2所述的多个细胞外囊泡，其中所述胶原为I型胶原α1链(Col1A1)或前α1(I)链。
7.如权利要求6所述的多个细胞外囊泡，其中所述胶原为Col1A1，并且所述
8.如权利要求2所述的多个细胞外囊泡，其中所述胶原为Col1A2。
9.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡包含平均每450个EV至少一个所述外源性细胞外基质mRNA的拷贝。
10.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡包含平均每2000个EV、每1000个EV、每500个EV、每400个EV、每300个EV、每200个EV、每150个EV、每100个EV、每90个EV、每80个EV、每70个EV、60个EV、50个EV、每40个EV、每30个EV、每20个EV、每15个EV、每10个EV、每5个EV、每2个EV或每1个EV至少一个所述外源性细胞外基质mRNA的拷贝。
11.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中通过用编码细胞外基质蛋白的质粒转染细胞来产生所述多个细胞外囊泡。
12.如权利要求11所述的多个细胞外囊泡，其中所述细胞的所述转染通过细胞纳米穿孔进行。
13.如前两项权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述细胞为人细胞。
14.如前三项权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述细胞为选自以下的成纤维细胞：真皮成纤维细胞、人成纤维细胞、成体成纤维细胞、人成体成纤维细胞、新生儿成纤维细胞、人新生儿成纤维细胞和人新生儿真皮成纤维细胞。
15.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡包括选自以下的细胞外囊泡：外泌体、微囊泡、凋亡小体及其任何组合。
16.如权利要求15所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡包括至少一个外泌体。
17.如权利要求15所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡包括以下中至少任何两个的混合物：外泌体、微囊泡或凋亡小体。
18.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡被配制用于经由静脉内途径、肌内途径、皮下途径或其任何组合来注射。
19.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡包括至少1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡。
20.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡包含至少1ng、10ng、20ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg所述细胞外基质mRNA。
21.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡包含直径的峰值在50nm-200nm处的大小分布。
22.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述细胞外囊泡的直径大于20nm、30nm、50nm、75nm或100nm。
23.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述外源性细胞外基质mRNA存在的水平是相同量的天然存在的细胞外囊泡中所述外源性细胞外基质mRNA的水平的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少50倍、至少75倍、至少100倍、至少50...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.多个细胞外囊泡，其包含外源性细胞外基质信使rna(mrna)。
2.如权利要求1所述的多个细胞外囊泡，其中所述外源性细胞外基质mrna编码胶原。
3.如权利要求2所述的多个细胞外囊泡，其中所述胶原选自：i型胶原、ii型胶原、iii型胶原、iv型胶原、v型胶原、vi型胶原、vii型胶原、viii型胶原、ix型胶原、x型胶原、xi型胶原、xii型胶原、xiii型胶原、xiv型胶原、xv型胶原、xvi型胶原、xvii型胶原、xviii型胶原、xix型胶原、xx型胶原、xxi型胶原、xxii型胶原、xxiii型胶原、xxiv型胶原、xxv型胶原、xxvi型胶原、xxvii型胶原、xxviii型胶原或其任何组合。
4.如权利要求2所述的多个细胞外囊泡，其中所述胶原为i型胶原。
5.如权利要求2所述的多个细胞外囊泡，其中所述胶原为ii型胶原。
6.如权利要求2所述的多个细胞外囊泡，其中所述胶原为i型胶原α1链(col1a1)或前α1(i)链。
7.如权利要求6所述的多个细胞外囊泡，其中所述胶原为col1a1，并且所述多个细胞外囊泡不包含i型胶原α2链(col1a2)。
8.如权利要求2所述的多个细胞外囊泡，其中所述胶原为col1a2。
9.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡包含平均每450个ev至少一个所述外源性细胞外基质mrna的拷贝。
10.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡包含平均每2000个ev、每1000个ev、每500个ev、每400个ev、每300个ev、每200个ev、每150个ev、每100个ev、每90个ev、每80个ev、每70个ev、60个ev、50个ev、每40个ev、每30个ev、每20个ev、每15个ev、每10个ev、每5个ev、每2个ev或每1个ev至少一个所述外源性细胞外基质mrna的拷贝。
11.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中通过用编码细胞外基质蛋白的质粒转染细胞来产生所述多个细胞外囊泡。
12.如权利要求11所述的多个细胞外囊泡，其中所述细胞的所述转染通过细胞纳米穿孔进行。
13.如前两项权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述细胞为人细胞。
14.如前三项权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述细胞为选自以下的成纤维细胞：真皮成纤维细胞、人成纤维细胞、成体成纤维细胞、人成体成纤维细胞、新生儿成纤维细胞、人新生儿成纤维细胞和人新生儿真皮成纤维细胞。
15.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡包括选自以下的细胞外囊泡：外泌体、微囊泡、凋亡小体及其任何组合。
16.如权利要求15所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡包括至少一个外泌体。
17.如权利要求15所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡包括以下中至少任何两个的混合物：外泌体、微囊泡或凋亡小体。
18.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡被配制用于经由静脉内途径、肌内途径、皮下途径或其任何组合来注射。
19.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡包括至少1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、3x108、5x108、1x109、3x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1020、1x1025或1x1030个细胞外囊泡。
20.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡包含至少1ng、10ng、20ng、40ng、50ng、100ng、500ng、1μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg所述细胞外基质mrna。
21.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述多个细胞外囊泡包含直径的峰值在50nm-200nm处的大小分布。
22.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述细胞外囊泡的直径大于20nm、30nm、50nm、75nm或100nm。
23.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述外源性细胞外基质mrna存在的水平是相同量的天然存在的细胞外囊泡中所述外源性细胞外基质mrna的水平的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少50倍、至少75倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍、至少1500倍或至少2000倍。
24.如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中与可比数量的天然存在的细胞外囊泡相比，所述多个细胞外囊泡表达较高水平的以下标志物中的至少一个：cd9、cd63、tsg101或arf6。
25.一种容器，其包含如前述权利要求中任一项所述的多个细胞外囊泡，其中所述容器还包括细胞。
26.如前述权利要求中任一项所述的容器，其中所述细胞包括人细胞、人成纤维细胞、成纤维细胞、真皮成纤维细胞、人成纤维细胞、成体成纤维细胞、人成体成纤维细胞、新生儿成纤维细胞、人新生儿成纤维细胞、人新生儿真皮成纤维细胞或其任何组合。
27.如前两项权利要求中任一项所述的容器，其中所述多个细胞外囊泡以每个细胞至少1000、2000、5000、10000或12000个细胞外囊泡的比率存在于所述容器中。
28.一种针，其包含如权利要求1至24中任一项所述的多个细胞外囊泡。
29.如前一项权利要求所述的针，其中所述针为微针。
30.如前两项权利要求中任一项所述的针，其中所述针为水凝胶针。
31.如权利要求30所述的针，其中所述水凝胶包含透明质酸、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸、软骨硫黄素、丝蛋白、麦芽糖、壳聚糖、羧甲基纤维素或其任何组合。
32.如权利要求31所述的针，其中所述水凝胶包含透明质酸。
33.如权利要求32所述的针，其中所述水凝胶包含至少1％、5％、7％、10％、12％、15％、20％、25％、50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％透明质酸。
34.一种注射器，其包括如权利要求1至24中任一项所述的多个细胞外囊泡。
35.如前一项权利要求所述的注射器，其中所述多个细胞外囊泡悬浮在透明质酸中。
36.一种水凝胶微针，其中所述水凝胶微针包含多个细胞外囊泡。
37.如前一项权利要求所述的水凝胶微针，其中所述水凝胶包含至少1％、5％、7％、10％、12％、15％、20％、25％、50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％透明质酸。
38.如前两项权利要求中任一项所述的水凝胶微针，其中所述水凝胶包含透明质酸、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸、软骨硫黄素、丝蛋白、麦芽糖、壳聚糖、羧甲基纤维素或其任何组合。
39.如前述权利要求中任一项所述的水凝胶微针，其中所述多个细胞外囊泡包括选自以下的细胞外囊泡：外泌体、微囊泡、凋亡小体及其任何组合。
40.如前述权利要求中任一项所述的水凝胶微针，其中所述水凝胶微针包含负载一个或多个mrna货物的细胞外囊泡。
41.一种针，其包含多个细胞外囊泡，其中所述细胞外囊泡包含至少一个细胞外基质信使rna(mrna)。
42.如权利要求41所述的针，其中所述细胞外基质mrna编码胶原。
43.如权利要求42所述的针，其中所述胶原选自：i型胶原、ii型胶原、iii型胶原、iv型胶原、v型胶原、vi型胶原、vii型胶原、viii型胶原、ix型胶原、x型胶原、xi型胶原、xii型胶原、xiii型胶原、xiv型胶原、xv型胶原、xvi型胶原、xvii型胶原、xviii型胶原、xix型胶原、xx型胶原、xxi型胶原、xxii型胶原、xxiii型胶原、xxiv型胶原、xxv型胶原、xxvi型胶原、xxvii型胶原、xxviii型胶原或其任何组合。
44.如权利要求43所述的针，其中所述胶原为i型胶原。
45.如权利要求43所述的针，其中所述胶原为ii型胶原。
46.如权利要求43所述的针，其中所述胶原为i型胶原α1链(col1a1)或前α1(i)链。
47.如前述权利要求中任一项所述的针，其中所述针为水凝胶针，并且任选地其中所述针的至少50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％包含水凝胶。
48.如权利要求47所述的针，其中所述水凝胶包含透明质酸、海藻酸钠、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸、软骨硫黄素、丝蛋白、麦芽糖、壳聚糖、羧甲基纤维素或其任何组合。
49.一种治疗对象的皮肤病况的方法，其包括向有需要的对象施用至少一个细胞外基质mrna，从而治疗所述皮肤病况。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述外源性细胞外基质mrna编码胶原。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述胶原选自：i型胶原、ii型胶原、iii型胶原、iv型胶原、v型胶原、vi型胶原、vii型胶原、viii型胶原、ix型胶原、x型胶原、xi型胶原、xii型胶原、xiii型胶原、xiv型胶原、xv型胶原、xvi型胶原、xvii型胶原、xviii型胶原、xix型胶原、xx型胶原、xxi型胶原、xxii型胶原、xxiii型胶原、xxiv型胶原、xxv型胶原、xxvi型胶原、xxvii型胶原、xxviii型胶原或其任何组合。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述胶原为i型胶原。
53.如权利要求51所述的方法，其中所述胶原为ii型胶原。
54.如权利要求51所述的方法，其中所述胶原为i型胶原α1链(col1a1)或前α1(i)链。
55.如权利要求51所述的方法，其中所述胶原为col1a2。
56.如前述权利要求中任一项所述的方法，...
【专利技术属性】
技术研发人员：李利，施骏峰，郭广柱，安德鲁·斯蒂芬·李，尤祎，田雨，兰峰，鲁文静，
申请(专利权)人：鉴识生物系统有限公司，
类型：发明
国别省市：
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