【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种通过构建体内ce-mi酶级联催化体系提高乳糖到乳果糖转化率，属于酶工程。
技术介绍
1、乳果糖[lactulose，β-d-半乳糖基-1,4-d-果糖]是一种人工合成的非消化性二糖，属于乳糖[lactose,β-d-半乳糖基-1,4-d-葡萄糖]的一种功能衍生物。乳果糖是乳糖还原端葡萄糖基异构化为果糖的产物，作为一种不被消化的二糖，自1950年以来一直被用于治疗便秘和肝性脑病，因其在制药、营养食品和食品行业的商业价值不断增加而受到越来越多的关注。
2、自发现乳果糖以来，已有大量研究以提高乳果糖的产量、纯度并降低生产成本为目标。目前的商业乳果糖主要是基于化学方法生产的。但由于化学法存在转化率低、副产物多、产物难分离、使用化学试剂及大量能源等缺点，通过生物催化剂合成乳果糖是一种更绿色、安全的方法。当前用于酶法生产乳果糖的常用酶为纤维二糖差向异构酶(ce)，但由于中间产物依匹乳糖结构异构转化为乳果糖为反应的限速步骤，其转化率较低，限制了工业化应用。
3、迄今为止，已有多项研究针对caldicellulosiruptor saccharolyticus(csce)催化能力的改造，并已取得诸多成果，如通过随机突变和定点饱和突变提高其异构化和热稳定性等，但乳糖异构化生成乳果糖的关键性问题——即解决中间产物依匹乳糖异构化生成乳果糖这一限速步骤仍未解决。本研究从将甘露糖单向催化为果糖的甘露糖结构异构酶(mi)中挖掘出一种具有二糖催化活性的酶，即来源于marinomonas mediterranead的甘
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于为解决乳糖异构化生成乳果糖的关键限速步骤而提供的一种将csce与mmmi联用，构建体内酶级联催化体系及细胞工厂。相对于体外级联，本专利技术采用大肠杆菌发酵的方式将两酶体内级联，省略了酶的提取和纯化步骤，更为方便快捷；相对于单酶体内催化，本专利技术构建的酶级联催化体系及细胞工厂可将中间产物进一步转化为乳果糖，极大提高了乳果糖的产量，对于促进乳果糖的高效合成和工业化应用具有重要意义。为了实现上述目标，本专利技术采取的技术方案为：
2、(1)为探究酶发酵体系催化乳糖合成乳果糖的效果，将ce酶导入到大肠杆菌中进行表达；由于大肠杆菌乳糖操纵子的结构基因lacz编码的β-半乳糖苷酶可以切断乳糖的半乳糖苷链，将乳糖分解成葡萄糖和半乳糖，因此通过crispr-cas9基因编辑技术敲除了大肠杆菌bl21(de3)中的结构基因lacz，阻止底物的分解消耗，通过菌株发酵乳果糖产量达到3.55g/l。
3、(2)表征四种来源的mi对甘露糖和依匹乳糖的催化能力。采取hplc分析揭示，四种mi都对甘露糖表现出明显的异构化活性，但当使用依匹乳糖作为底物时，只有mmmi催化中检测到少量乳果糖，且其对依匹乳糖表现出显著的底物偏好，对乳果糖没有催化活性。选取mmmi作为ce-mi级联系统的催化模块。
4、(3)在敲除lacz的bl21(de3)中导入pet28b-csce和pet22b-mmmi质粒进行表达，构建了ce-mi双酶体内级联体系以促进副产物依匹乳糖的转化，乳果糖产量达到4.0g/l。
5、(4)通过对mmmi晶体结构与底物依匹乳糖结构的叠加，选取了mmmi-b柔性环上可能与底物依匹乳糖有氢键相互作用的残基l241、f242、r243及p244a作为改造位点进行改造。通过定点饱和突变，获得了一个结构异构催化能力显著提升的阳性突变体mmmi/f242n。mmmi/f242n与csce级联催化后乳果糖产量达到4.66g/l。
6、(5)通过单质粒共表达菌株的构建和rbs序列的优化进一步优化了双酶体内级联催化体系，在添加8g/l乳清粉(乳糖含量6.7g/l)作为底物时摇瓶发酵，乳果糖产量达到6.12g/l(乳果糖转化率91.3％)。
7、核心专利技术点在于：
8、(1)挖掘出一个具有催化依匹乳糖生成乳果糖的mi酶(mmmi)，且其几乎不具备反向异构乳果糖为依匹乳糖的能力，将该酶与ce级联后其乳果糖的生产能力较ce单酶催化显著提升。(2)通过对mmmi的loopb进行定点改造，得到1个结构异构催化能力显著提升的突变体mmmi/f242n。(3)将阳性突变体mmmi/f242n与csce/q371e构建体内级联催化体系，极大提升了乳糖异构生成乳果糖的转化率和产量。(4)通过rbs工程调控，可以提升mmmi/f242n与csce/q371e级联细胞工厂的乳糖发酵能力，产量达到6.12g/l(乳果糖转化率91.3％)。(5)通过crispr-cas9基因编辑技术敲除了大肠杆菌bl21(de3)中的结构基因lacz，构建了更有利于乳糖发酵生产乳果糖的大肠杆菌宿主。
9、本专利技术提供了一种d-甘露糖异构酶mmmi突变体，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.6所示的d-甘露糖异构酶mmmi的第241位的亮氨酸突变为丙氨酸或谷氨酸得到的，命名为l241a或l241e；
10、或将氨基酸序列如seq id no.6所示的d-甘露糖异构酶mmmi的第242位的苯丙氨酸突变为谷氨酸、天冬酰胺或苏氨酸得到的，命名为f242e、f242n或f242t；
11、或将氨基酸序列如seq id no.6所示的d-甘露糖异构酶mmmi的第243位的精氨酸突变为甘氨酸，命名为r243g；
12、或将氨基酸序列如seq id no.6所示的d-甘露糖异构酶mmmi的第244位的脯氨酸突变为丙氨酸得到的，命名为p244a。
13、本专利技术还提供了一种含有上述突变体的基因。
14、本专利技术还提供了一种含有上述突变体的重组载体。
15、本专利技术还提供了一种含有上述基因或重组载体的重组细胞。
16、在本专利技术的一种实施方式中，所述重组细胞是以真菌或细菌为表达宿主。
17、本专利技术还提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是以敲除基因组上的lacz为宿主细胞，并进行以下(a)～(d)中的任一种改造：
18、(a)过表达了氨基酸序列如seq id no.4所示的csce/q371e，同时过表达了来源于marinomonas mediterranea的mmmi酶或权利要求1所述的突变体；
19、(b)采用t7启动子和rbsw序列过表达了氨基酸序列如seq id no.4所示的csce/q371e，同时采用t7启动子和rbsw序列过表达了权利要求1所述的突变体；优选的，所述突变体为f242n；所述rbsw序列为aataattttgtttaactttaagaaggagat；
20、(c)采用t7启动子和rbsw序列过表达了氨基酸序列如seq id no.4所示的csce/q371e，同时采用t7启动子和rbs29序列过本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种D-甘露糖异构酶MmMI突变体，其特征在于，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQID NO.6所示的D-甘露糖异构酶MmMI的第241位的亮氨酸突变为丙氨酸或谷氨酸得到的，命名为L241A或L241E；
2.含有权利要求1所述突变体的基因或者载体或重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是以真菌或细菌为表达宿主。
3.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌是以敲除其基因组上的lacZ为宿主细胞，并进行以下(a)～(d)中的任一种改造：
4.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌是以E.coliBL21(DE3)为表达宿主，以pET28b为表达载体，表达了CsCE/Q371E；以pET22b为表达载体，表达了MmMI酶或权利要求1所述的突变体。
5.根据权利要求3或4所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述lacZ的氨基酸序列如SEQID NO.2所示；所述MmMI酶氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
6.一种提高大肠杆菌以乳糖为底物发酵制备乳果糖的方法，其特征在于，所述方法为，敲除大肠杆
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌是以E.coli BL21(DE3)为表达宿主，以pET28b为表达载体，表达了CsCE/Q371E；以pET22b为表达载体，表达了MmMI酶或权利要求1所述的突变体。
8.一种乳果糖的制备方法，其特征在于，所述方法为，采用权利要求3～5任一所述的重组大肠杆菌发酵制备得到的。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法为，将所述重组大肠杆菌添加至含有乳糖或乳清粉的反应体系中进行发酵，制备得到乳果糖。
10.权利要求1所述的突变体，或权利要求2所述的基因或者载体或重组细胞，或权利要求3～5任一所述的重组大肠杆菌，或权利要求6～9任一所述的方法在制备乳果糖或含有乳果糖的食品、药品或保健品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种d-甘露糖异构酶mmmi突变体，其特征在于，所述突变体为，将氨基酸序列如seqid no.6所示的d-甘露糖异构酶mmmi的第241位的亮氨酸突变为丙氨酸或谷氨酸得到的，命名为l241a或l241e；
2.含有权利要求1所述突变体的基因或者载体或重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是以真菌或细菌为表达宿主。
3.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌是以敲除其基因组上的lacz为宿主细胞，并进行以下(a)～(d)中的任一种改造：
4.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌是以e.colibl21(de3)为表达宿主，以pet28b为表达载体，表达了csce/q371e；以pet22b为表达载体，表达了mmmi酶或权利要求1所述的突变体。
5.根据权利要求3或4所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述lacz的氨基酸序列如seqid no.2所示；所述mmmi酶氨基酸序列如seq id no.6所示。...
【专利技术属性】
技术研发人员：吕小妹，曾秋倩，杨瑞金，赵伟，王璐，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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