【技术实现步骤摘要】
本公开属于基因工程领域，具体涉及利用基因编辑技术建立早衰模型猪的方法。
技术介绍
1、klotho是一种抗衰老基因，编码一种单通道跨膜蛋白，膜型klotho蛋白是骨源性激素f gf-23必要的共受体，参与抑制磷酸盐的重吸收和维生素d的合成。另一种分泌至细胞外的分泌型klotho蛋白可能作为体液因子调节多种离子通道活性及信号转导，发挥抗炎、抗凋亡等多种生物学功能。
2、有研究发现，klotho缺乏小鼠会出现类似人类衰老的各种表现，包括动脉硬化、血管和软组织钙化、皮肤萎缩、骨质疏松、肺气肿、性腺发育不良、不孕、活动减退、听觉障碍、认知损伤、寿命缩短等。
3、klotho蛋白作为一种循环激素，与细胞表面受体结合，抑制胰岛素和胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，igf1)的细胞内信号，这是一种进化上保守的延长寿命的机制。通过干扰胰岛素和igf1信号传导，观察到klotho缺陷小鼠的衰老样表型减轻，这表明klotho介导的对胰岛素和igf-1信号传导的抑制有助于其抗衰老特性。klotho蛋白可能在哺乳动物中起到抗衰老激素的作用。小鼠过表达人源klotho基因可以明显延长小鼠寿命、改善血糖等生理指标。
4、氧化应激是引起衰老的主要原因，也参与了许多疾病的发生发展。近年来很多证据表明klotho与机体氧化应激和衰老密切相关。衰老的肾脏会表现出肾小管上皮细胞损伤、脱落甚至出现矿化，肝脏的衰老特征为肝细胞萎缩、炎症细胞浸润等病理特征。主动脉夹层作为血管衰老的重要标志也发
技术实现思路
1、本公开提供了一种早衰模型猪的建立方法，获得可遗传且表型稳定的早衰猪模型。
2、本公开的一方面提供了一种早衰模型猪的建立方法，所述方法包括利用基因编辑技术获得klotho基因表达降低或缺失的猪受精卵或猪体细胞。
3、在一些实施方式中，所述基因编辑技术选自be3单碱基编辑技术、crispr、talen和zfn，优选为crispr/cas9。
4、在一些实施方式中，所述方法包括对klotho基因的1号外显子进行靶向突变，优选地，所述突变包括核苷酸的插入、取代或缺失。
5、在一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：
6、(1)根据猪klotho基因的1号外显子的序列确定打靶位点；
7、(2)根据步骤(1)确定的打靶位点合成sgrna序列，然后将合成的序列与骨架载体连接构建sgrna打靶载体；
8、(3)将步骤(2)获得的sgrna载体和cas9质粒导入猪受精卵或猪体细胞中，获得klotho基因表达降低或缺失的猪受精卵或猪体细胞。
9、在一些实施方式中，步骤(1)中，根据猪klotho基因的1号外显子的序列确定3条sgrna，所述3条sgrna的核苷酸序列及其互补核苷酸序列包括：
10、sgrna1：ccgtcgggcgtcccgtcgccgac(seq id no:2)
11、sgrna1的互补序列：gtcggcgacgggacgcccgacgg(seq id no:3)
12、sgrna2：caacaacgtcttccgggacacgg(seq id no:4)
13、sgrna2的互补序列：ccgtgtcccggaagacgttgttg(seq id no:5)
14、sgrna3：gcgaggggctgcgctactaccgg(seq id no:6)
15、sgrna3的互补序列：ccggtagtagcgcagcccctcgc(seq id no:7)
16、在一些实施方式中，所述方法还包括将klotho基因表达降低或缺失的猪受精卵移植到受体母猪的输卵管内，从而制备早衰模型猪。
17、在另一些实施方式中，所述方法还包括将klotho基因表达降低或缺失的猪体细胞的细胞核移植到猪去核卵母细胞中，然后将核移植后的猪去核卵母细胞移植到受体母猪的输卵管内，从而制备早衰模型猪。
18、在一些实施方式中，所述猪体细胞来自如下的组织或器官：胎儿组织、皮肤、肌肉、耳、乳腺、输卵管、卵巢、血液、尿液、脂肪、骨髓、血管和管腔内皮。
19、在一些实施方式中，所述猪体细胞选自胎儿成纤维细胞、皮肤细胞、上皮细胞、耳细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肌肉细胞、乳腺细胞、输卵管细胞、卵巢细胞、卵丘细胞、神经细胞和成骨细胞。
20、在一些实施方式中，所述早衰模型猪的基因组编码如seq id no:11、13和/或15所示的氨基酸序列，或所述早衰模型猪的基因组包含如seq id no:10、12和/或14所示的核苷酸序列。
21、在一些实施方式中，所述早衰模型猪的基因组编码如seq id no:11和/或15所示的氨基酸序列，和/或，所述早衰模型猪的基因组包含如seq id no:10和/或14所示的核苷酸序列。
22、在一些实施方式中，所述早衰模型猪的基因组编码如seq id no:11和/或13所示的氨基酸序列，和/或，所述早衰模型猪的基因组包含如seq id no:10和/或12所示的核苷酸序列。
23、在一些实施方式中，所述早衰模型猪中的klotho蛋白表达缺失。
24、在一些实施方式中，所述早衰模型猪具有seq id no:11、13和/或15所示的氨基酸序列。
25、在一些实施方式中，所使用的骨架载体除真核载体外，还可包括慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、非病毒载体等基因载体。
26、在一些实施方式中，本公开利用基因编辑技术，根据猪klotho基因序列的外显子选择打靶位点序列，并且根据打靶位点序列构建了sgrna打靶载体和crispr/cas9表达载体，载体经验证有效后，将cas9质粒和sgrna质粒共电转染至猪的胎儿成纤维细胞中，挑取细胞单克隆，将阳性克隆细胞分别核移植至成熟的猪去核卵母细胞，进行融合后电激活，随后体外培养克隆胚胎，从而制备早衰模型猪。
27、本公开的另一方面还提供而由所述建立方法获得的早衰模型猪的猪体细胞、组织或器官。
28、在一些实施方式中，所述早衰模型猪的基因组编码如seq id no:11、13和/或15所示的氨基酸序列，和/或，所述猪体细胞、组织或器官包含如seq id no:10、12和/或14所示的核苷酸序列。
29、在一些实施方式中，所述早衰模型猪的基因组编码如seq id no:11和/或15所示的氨基酸序列，和/或，所述早衰模型猪的基因组包含如seq id no:10或14所示的核苷酸序列。
30、在一些实施方式中，所述早衰模型猪的基因组编码如seq id no:11和/或13所示的氨基酸序列，和/或，所述早衰模型猪的基因组包含如seq id no:10或12所示的核苷酸序列。
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【技术保护点】
1.早衰模型猪的建立方法，所述方法包括利用基因编辑技术获得Klotho基因表达降低或缺失的猪受精卵或猪体细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因编辑技术选自BE3单碱基编辑技术、CRISPR、TALEN和ZFN，优选为CRISPR/Cas9。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括对Klotho基因的1号外显子进行靶向突变，优选地，所述突变包括核苷酸的插入、取代或缺失。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将Klotho基因表达降低或缺失的猪受精卵移植到受体母猪的输卵管内，从而制备早衰模型猪；或者
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述早衰模型猪的基因组编码如SEQ IDNO:11、13和/或15所示的氨基酸序列，或所述早衰模型猪的基因组包含如SEQ ID NO:10、12和/或14所示的核苷酸序列；或者，
7.由权利要求1-6任一项的建立方法获得的早衰模型猪的猪体细胞、组织或器官；
8.一种早衰模型猪的猪体细胞，所述猪体细胞的基因组编码如SEQ ID NO:11、13和/或15所示的氨基酸序列，或所述猪体细胞的基因组包含如SEQ ID NO:10、12和/或14所示的核苷酸序列；
9.猪Klotho基因编辑的打靶载体，所述打靶载体由针对猪Klotho基因的1号外显子确定的打靶位点序列设计的sgRNA序列以及骨架载体构成；
10.一种细胞，所述细胞包含权利要求9所述的打靶载体，优选地所述细胞不能发育为动物。
11.权利要求1-6中任一项所述的方法获得的早衰模型猪在多器官衰竭及衰老综合征药物的筛选和/或评估中的应用。
...【技术特征摘要】
1.早衰模型猪的建立方法，所述方法包括利用基因编辑技术获得klotho基因表达降低或缺失的猪受精卵或猪体细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因编辑技术选自be3单碱基编辑技术、crispr、talen和zfn，优选为crispr/cas9。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括对klotho基因的1号外显子进行靶向突变，优选地，所述突变包括核苷酸的插入、取代或缺失。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将klotho基因表达降低或缺失的猪受精卵移植到受体母猪的输卵管内，从而制备早衰模型猪；或者
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述早衰模型猪的基因组编码如seq idno:11、13和/或15...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨仕明，陈伟，郭维维，冀飞，米继东，赵建平，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：
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