【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物制药领域，具体地，涉及人血液中胶原酶中和抗体的检测方法、检测试剂盒及其应用。
技术介绍
1、中和抗体是指能够干扰药物与其靶点相互作用的抗药抗体。中和抗体可以通过阻断产品到达其靶标或干扰受体/配体结合的作用，从而干扰药物的体内活性。
2、中和活性试验评估抗药抗体对药物的中和程度，是指抗药抗体具有抑制药物生物学活性的能力。现有技术中，中和抗体检测方法通常采用基于细胞的中和活性检测方法。但是，当药物在体内的作用机制与细胞关系较小，例如体液中游离靶点的拮抗反应、酶反应等，或者由于生物基质干扰等因素，细胞学方法的变异程度、定量范围、灵敏度等难以满足中和抗体方法学验证和样本分析的需要时，可能需采用基于非细胞的试验方法(配体结合分析、酶反应等)。
3、近几十年，中心型肥胖在人群中广泛流行并呈现加速上升的趋势，中心型肥胖又称腹型肥胖，是指脂肪组织在腹腔或腹部周围的异常堆积。腰腹部属于人体的核心部位之一，很多人有长期久坐的习惯并且缺乏锻炼，导致腰腹部的脂肪堆积，形成“苹果型身材”。
4、虽然节食、运动对消除肥胖有一定作用，但是对于一些局部无效的顽固性肥胖仍无有效解决方法。多年来，手术吸脂一直是减少腹部脂肪的主要手段。吸脂术的并发症主要有血肿、肺功能障碍、手术感染以及静脉栓塞，其中静脉栓塞是主要致死原因。除手术治疗外，目前还有无创性塑性治疗手段，如低水平激光治疗、低温脂肪分解、射频和高强度聚焦超声等，虽然避免了传统有创塑性需要住院、麻醉风险、疼痛、肿胀时期长、恢复期长、感染风险大的缺点，但是这些
5、胶原酶能够作用于脂肪组织细胞外基质(ecm)上附着的脂肪细胞，通过破坏脂肪细胞中的胶原网络使脂肪细胞游离，从而诱导脂肪细胞凋亡而达到溶脂，进而可以改善颏下脂肪堆积和腰腹部脂肪堆积而达到塑形的效果。胶原酶为患者提供更多的治疗选择，满足颏下脂肪堆积和腰腹部脂肪堆积肥胖患者的巨大临床需求。
6、近年来，国内创新药研究发展迅猛，尤其治疗性蛋白药物研究与开发日益增多，免疫原性相关研究也越来越广泛。免疫原性可能中和药物的生物学活性，或产生交叉免疫反应，也可能导致其他不良事件的发生，对患者的安全性和药物的有效性均有显著影响。因此，中和抗体的检测成为药物开发阶段的重要事项。
7、中和抗体检测方法基于多种因素进行考虑，包括药物本身的作用机制、方法的选择性、生物基质的干扰程度等。一般采用基于细胞的中和活性检测方法，也可能采用基于非细胞的试验方法(配体结合分析、酶反应等)。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术课题
2、由于胶原蛋白是细胞外间质成分，胶原酶(降解胶原蛋白)在体内的作用机制与细胞关系较小。开发基于细胞的中和抗体方法，可能导致难以满足胶原酶中和抗体方法验证和样本分析的需求。
3、目前未见关于胶原酶中和抗体的检测方法，本专利技术提供了一种快递简便的检测方法，可以快速准确的鉴定分析样品中是否有胶原酶中和抗体。
4、解决技术课题的技术方案
5、为了解决上述技术问题，本专利技术提出基于一种酶活性测定法检测人血清中胶原酶中和抗体的分析方法。即用以fitc(异硫氰酸荧光素)标记的胶原蛋白作为底物，检测抑制胶原酶活性原理，达到检测胶原酶中和抗体的中和活性，并应用于分析临床试验样本。该方法快捷简便、稳健可靠、药物耐受水平较高，适用于分析胶原酶药物临床受试者血样。
6、胶原酶中和抗体检测方法的原理：在含有氯化钙和氯化钠的溶液中分别加入fitc标记的胶原蛋白和胶原酶工作溶液，再加入酶抑制剂邻菲罗啉(o-phenanthroline)或者血液样品与上述混合溶液共同孵育，通过酶标仪对反应的结果进行检测。样品中胶原酶的中和抗体浓度与检测信号成反比，通过计算相关参数判断样品中胶原酶中和抗体为阴性或阳性。
7、本专利技术首先进行了检测方法的开发，包括通过选择性鉴别(正常基质、溶血基质和高血脂基质)基质效应评价非特异性水平的高低，筛选合适的阳性对照评价检测方法的分析灵敏度，通过不同分析人员、不同反应时间、不同批次样品分析检测方法的精密度，通过灵敏度测试反映待测样品的最低检测水平等。
8、完成分析方法开发后，进行了检测方法的全面验证，包括但不限于：分析临界值(acp)、分析灵敏度、系统适应性、精密度、稳健性、选择性、稳定性、药物耐受和钩状效应。
9、本专利技术包括如下技术方案。
10、本专利技术提供一种检测血液样品中胶原酶中和抗体的方法，包括以下步骤：
11、(1)配制待检测血液样品和阴性质控样品，阴性质控样品用来作为每个分析批的nc，
12、(2)样品孵育：
13、分别取配制好的待检测血液样品和阴性质控样品至稀释板中，然后分别加入胶原酶工作溶液，再分别加入带有标记物的胶原蛋白荧光底物工作溶液，最后分别加入氯化钙溶液和氯化钠溶液，孵育；
14、(3)检测：取上清液在酶标仪中检测荧光；
15、(4)数据采集与计算：
16、抑制率(％)＝100×(1-待检测血液样品复孔信号均值/阴性质控样品的信号均值)(％)
17、(5)结果分析：
18、若血液样品的抑制率低于分析临界值则判定为不具有中和活性，若血液样品的抑制率高于或等于分析临界值则判定为具有中和活性，所述分析临界值为34.1。
19、本专利技术的检测方法中，所述阴性质控样品优选来源于健康人个体血液。
20、本专利技术的检测方法中，所述待检测血液样品选自人类血清或全血。
21、本专利技术的检测方法中，所述检测步骤中，酶标仪设置为激发光490nm、发射光520nm。
22、本专利技术的检测方法中，所述孵育是在37℃、孵育4h±20min。
23、本专利技术的检测方法中，所述标记物优选是异硫氰酸荧光素。
24、本专利技术的检测方法还包括采用阳性对照评价检测方法的分析灵敏度，所述阳性对照样品是邻菲罗啉。
25、本专利技术还提供一种用于检测人血清中胶原酶中和抗体的试剂盒，包括：胶原酶工作溶液、带有标记物的胶原蛋白荧光底物工作溶液、氯化钙溶液、氯化钠溶液以及阴性质控样品。
26、本专利技术的试剂盒还包括：tris-hcl溶液、溶血基质和血脂基质。
27、本专利技术的试剂盒中，所述标记物是异硫氰酸荧光素。
28、本专利技术的试剂盒中，所述阴性质控样品来源于混合的健康人个体血液。
29、有益的技术效果
30、本专利技术的胶原酶中和抗体检测方法可以快速稳定的检测临床受试者血样中有无中和抗体，更准确的评估胶原酶药物诱发的人体免疫应答或免疫相关事件的能力，为本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测血液中胶原酶中和抗体的方法，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，所述阴性质控样品来源于健康人个体血液。
3.如权利要求1所述的方法，还包括采用阳性对照评价检测方法的分析灵敏度，所述阳性对照样品是邻菲罗啉。
4.如权利要求1所述的方法，所述待检测血液样品选自人类血清或全血。
5.如权利要求1所述的方法，所述检测步骤中，酶标仪设置为激发光490nm、发射光520nm。
6.如权利要求1所述的方法，所述孵育是在37℃孵育4h±20min。
7.如权利要求1所述的方法，所述标记物选自异硫氰酸荧光素。
8.一种用于检测人血清中胶原酶中和抗体的试剂盒，包括：胶原酶工作溶液、带有标记物的胶原蛋白荧光底物工作溶液、氯化钙溶液、氯化钠溶液以及阴性质控样品。
9.如权利要求8所述的试剂盒，还包括：Tris-HCl溶液、溶血基质和血脂基质。
10.如权利要求8所述的试剂盒，所述标记物是异硫氰酸荧光素，所述阴性质控样品是健康人个体血液。
【技术特征摘要】
1.一种检测血液中胶原酶中和抗体的方法，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，所述阴性质控样品来源于健康人个体血液。
3.如权利要求1所述的方法，还包括采用阳性对照评价检测方法的分析灵敏度，所述阳性对照样品是邻菲罗啉。
4.如权利要求1所述的方法，所述待检测血液样品选自人类血清或全血。
5.如权利要求1所述的方法，所述检测步骤中，酶标仪设置为激发光490nm、发射光520nm。
6.如权利要求1所述的方法，...
【专利技术属性】
技术研发人员：金凯明，王丹，周涓，雷磊，李常辉，周映聪，胡欣，
申请(专利权)人：晨笛医药科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：
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