一种高效固氮微生物诱变育种方法技术

本发明专利技术公开了一种高效固氮微生物诱变育种方法，这一方法是采用２４００～２５００ＭＨｚ、中心波长１２２ｍｍ的微波对固氮微生物培养液辐照处理一定时间。这一特定波长的微波能对固氮微生物某些特定ＤＮＡ片段发生诱变作用，引起菌株固氮能力的遗传变异，用２４５０ＭＨｚ的微波辐射诱变处理效果最好。通过以无氮培养基分离和菌株固氮酶活性的测定，对高效固氮突变株进行多代定向选择，选育出具有固氮能力强于原始株的稳定高效突变株。本发明专利技术与紫外线诱变、高能粒子束诱变和化学诱变等诱变方式相比较，具有安全清洁、设备简单、廉价高效的特点，可以提高高效固氮微生物的育种效率和降低育种成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物诱变育种领域，具体地，涉及一种固氮微生物诱变育种方法。
技术介绍
固氮菌是指能够自由生活并将空气中的氮气固定成可被植物利用的有效氮的微 生物。以固氮微生物制成的微生物促生肥料，目前已广泛应用于农业生产中，无毒无害，不 污染环境，增产作用明显，增产幅度一般达5% 17.9%，施用于有效氮较低的耕作土壤内 增产效果达22. 34%。国内外都在积极研究和开发应用。我国的固氮微生物肥料生 产应用已有近50年的历史，取得了良好的经济效益。作为固氮菌肥料生产和应用的基础， 高效固氮菌株的选育是固氮菌肥料研制和开发最重要的步骤。但野生固氮菌株的固氮能力 往往较弱，达不到有效促生的目的。目前，高效固氮微生物诱变选育常采用紫外线辐照诱变、化学诱变等方法，其缺陷 在于存在一定的危险性，对操作人员的身体可能造成严重伤害，且选育出的高效菌株易产 生回复突变，遗传性状常不稳定。而高能粒子束及激光束照射诱变的方法则成本较高，其具 体操作也受设备条件和人员技术水平的影响，优良菌株的选育效率受到限制和弱化。因此 如何提高高效固氮微生物的选育效率，一直都是科研机构和菌剂研发部门研究的重点。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的上述缺陷，提出一种安全清洁、设备简单、廉价 高效的固氮微生物诱变育种方法，可以提高高效固氮微生物的育种效率和降低育种成本。实现上述目的的技术方案如下，包括固氮微生物的诱变处理、筛选及多代定 向选择，所述诱变处理是采用2400 2500MHz、中心波长122mm的微波辐照处理固氮微生物 培养液，辐照功率为100W 1050W，照射时间为5s 240s。本专利技术主要是采用2400 2500MHz、中心波长122mm的微波对固氮微生物培养液 和纯菌体培养物辐照处理一定时间。这一特定波长的微波能对固氮微生物某些特定DNA片 段发生诱变作用，引起菌株固氮能力的遗传变异，用2450MHz的微波辐射诱变处理效果最 好。进一步地，所述固氮微生物培养液在600nm时的OD值为0. 5及以上。进一步地，所述固氮微生物为苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)，微波辐照功率 为800W，照射时间为12s。进一步地，所述固氮微生物为圆褐固氮菌(Azotobocter chroococcum)，微波辐照 功率为150W，照射时间为178s，或辐照功率为100W，照射时间为240s。进一步地，所述固氮微生物为克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)，微波辐照功率为 250W，照射时间为36s。进一步地，所述固氮微生物为红豆草根瘤菌(Rhizobium)，微波辐照功率为1050W，照射时间为5s。上述不同的固氮微生物，在以上特定的辐照功率、照射时间参数下，正突变率均达到最高。进一步地，在本专利技术中，所述筛选的步骤为将经微波辐照诱变处理后的固氮微生 物的菌悬液涂布于Winogradsky无氮固体培养基上培养，选择菌落生长直径明显大于原始 菌株的突变株，后采用乙炔还原法完成纯培养物的固氮酶活性定量测定，初步得到优良的 突变株。其中Winogradsky无氮固体培养基的配置方法如下培养基母液配制=KH2PO4(50. Og/L)，MgSOJH2O (25. Og/L)，NaCl (25. Og/L)， FeS047H20(l. Og/L)，Na2Mo042H20 (1. 0g/L)，MnS044H20(l. 0g/L)，加 1000ml 蒸馏水溶解后以 IM NaOH调节pH为7. 2，5ml培养基母液用10g/L的甘露醇溶液定容至1000ml，加入CaCO3 粉末(0. lg/L)，以2M H2SO4调pH值为6. 2。固体培养基经0. 45 μ m的微孔滤膜过滤后添加 琼脂15g/L，调节pH值为6. 8后高温高压灭菌。进一步地，在本专利技术中，所述多代定向选择的步骤为将经筛选得到的突变株培养 液施入栽培植物根部以验证突变株的促生效果，对固氮酶活性和植物促生效果均显著强于 出发菌株的突变株进行传代试验以测定其遗传稳定性，最终得到固氮促生能力遗传稳定的 菌株。本专利技术与化学诱变、紫外辐照诱变、高能粒子束辐照诱变、太空诱变等相比较，突 变株固氮能力增效高、诱变选育成本低、操作简单安全，育种效率高。目前促生微生物优良 菌种的诱变选育主要采用紫外辐照诱变、化学诱变、高能粒子束及高能电子束辐照的方法， 其诱变原方式各异，但根本的原理都是通过破坏菌体原有DNA结构和碱基序列，并使其产 生重组和修复，在此过程中产生可遗传的变异。紫外诱变由于穿透性较弱，需要人工对菌液 进行搅拌，使大量菌体接触到紫外线照射，而化学诱变所使用的药品对人体有很强的致癌 致病性，因此紫外线辐照诱变和化学诱变对人体可能造成的伤害较大。高能粒子束辐照诱 变则相对安全，但超过一定剂量后，菌液会出现次生放射性。此外，高能粒子束辐照的设备 昂贵，仅能在少数有条件的研发单位完成。微波辐照诱变固氮微生物不存在次生放射性问 题，也没有化学药剂的残留和污染，安全性高。由于微波辐照使用的设备廉价易得，操作简 便，也提高了菌株选育的效率和降低了选育成本，具有很好的实用性和可靠性。本专利技术的高效固氮微生物微波诱变育种的主要优点为1、设备廉价、辐照条件可控性和安全性好由于微波辐照处理以民用微波炉为辐照源，设备廉价易得。辐照处理的主要参数 为辐照功率和辐照时间，均可通过调整辐照火力档位和照射时间来控制，降低了菌株辐照 诱变的操作难度。目前普通微波炉安全性都比较高，不会出现微波泄漏，同时微波辐照的原 理与粒子束辐照不同，不论剂量大小，处理后的菌液都不存在次生放射性的可能，这对操作 人员的安全提供了保障。2、高效突变株选育效率高固氮微生物菌株经过微波辐照诱变后，在最优辐照参数下，克雷伯氏菌(250W， 36s)，苜蓿根瘤菌(800W，12s)、圆褐固氮菌(150W, 178s或100W，240s)、红豆草根瘤菌 (1050ff,5s)等固氮微生物均可达到14%以上的正突变率。结合无氮培养基上的单菌落直4径大小来定性比较突变菌株的固氮能力，以乙炔还原法完成纯培养物的固氮酶活性定量测 定，即可在1 2周内完成菌株的诱变和筛选过程，初步得到优良的突变株。3、突变株固氮能力增效高经微波辐照时，具有电磁极性的水分子发生高频振荡，固氮微生物的DNA双链结 构受到水分子的剧烈摩擦，产生的增效变异较大。得到的优良突变株菌体纯培养物或其共 生固氮体系(根瘤)的固氮能力增效分别达47. 03% 3884. 01% (固氮菌纯培养物)和 26. 02% 159. 28% (共生固氮菌的根瘤)，与原始菌株差异均达极显著水平(P < 0. 01)；4、操作简便，易于掌握该技术原理简单易于理解，涉及的固氮微生物优良株筛选方法已比较成熟，便于 操作，能够适应不同的生产和研发环境。具体实施例方式以下对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用 于说明和解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。以苜蓿根瘤菌、圆褐固氮菌、克雷伯氏菌、红豆草根瘤菌等固氮菌种为例来说明本 专利技术的微波辐照诱变育种方法采用2400 2500MHz、中心波长122mm的微波对固氮微生物的培养菌液(OD6tltlnm =本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效固氮微生物诱变育种方法，包括固氮微生物的诱变处理、筛选及多代定向选择，其特征在于：所述诱变处理是采用２４００～２５００ＭＨｚ、中心波长１２２ｍｍ的微波辐照处理固氮微生物培养液，辐照功率为１００Ｗ～１０５０Ｗ，照射时间为５ｓ～２４０ｓ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李剑峰，师尚礼，张淑卿，霍平慧，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：62