【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，具体涉及植物叶绿体和线粒体单体胞嘧啶碱基编辑器及其应用方法。
技术介绍
1、基因组编辑在生命科学、医学和农业的基础和应用研究中具有广阔的前景。它依赖于酶试剂来改变基因组dna，从而以稳定且可传递的方式(用于动物或作物育种)或不可传递的方式(例如体细胞，用于基因治疗)导致感兴趣的基因组(例如核、叶绿体、线粒体)的遗传变化。编辑试剂包括工程化锌指核酸酶(zfn)、转录激活子样效应核酸酶(talen)以及成簇规则间隔短回文重复序列(crispr)和crispr相关蛋白(cas)(crispr/cas)。这些试剂会在使用者选定的基因组位点引入双链dna断裂(dsb)或dna碱基的化学改变(例如胞嘧啶的脱氨处理)。
2、dsb的dna修复以及修复过程中的化学变化会导致使用者所期待的dna序列变异，包括那些可实现农业用植物农艺性状改良的序列变异。
3、基于crispr/cas的基因组编辑是最广泛使用的编辑核基因组的技术，但由于crispr的引导rna(grna)组件难以递送到真核生物的细胞器中，因此使用crispr/cas来编辑细胞器基因组是不可行的。为了克服这种限制，通过将线粒体转运肽与talen融合构建mttalen，被证明可以靶向线粒体并在线粒体基因组中进行基因编辑(kazama etal.2019)。mttalen的局限性是dsb修复效率低下，因此线粒体或细胞器的基因编辑效率通常非常低。
4、目前已经发展出两种类型更有效的依赖转录激活子样效应子(tale)阵列(靶向特异dn
5、1.1.11、由细菌来源的胞嘧啶脱氨酶结构域(即ddda)衍生的胞嘧啶碱基编辑器(ddcbe)。ddda是双链dna脱氨酶，能以双链dna为底物对胞嘧啶碱基进行胞苷脱氨(mok等，2020)。ddda具有强细胞毒性，为避免细胞毒性，ddda被分裂为dddatoxn和dddatoxc两部分(mok等，2020)。胞嘧啶碱基编辑器(ddcbe)由左侧(l)和右侧(r)两个融合蛋白组成。根据目标c·g到t·a碱基编辑位点两侧dna序列组装靶向该位点的tale-l和tale-r，其中tale-l与dddatoxn及尿嘧啶糖基化酶抑制剂(ugi)融合，tale-r与dddatoxc及另一个ugi融合；两种融合蛋白均在n端进一步与转运肽融合。转运肽可选择叶绿体转运肽(用于叶绿体基因编辑)和线粒体转运肽(用于线粒体基因编辑)。两种融合蛋白靶向叶绿体或线粒体基因组靶标序列后，dddatoxn和dddatoxc得以重新靠近并结合在一起，从而使双链dna的胞苷脱氨，同时ugi抑制脱氨胞嘧啶被修复，最终ddcbe以靶标特异性催化人类线粒体dna(mtdna)中的c·g到t·a的转化(mok等，2020)。根据不同物种密码子偏好性设计的ddcbe被进一步证实在植物叶绿体和线粒体中也具有c·g到t·a碱基编辑能力(kang等，2021；li等，2021).
6、(1)但是细菌胞苷脱氨酶ddda衍生的胞嘧啶碱基编辑器(ddcbe)在很大程度上仅限于底物dna 5'-tc环境中的c到t转换(例如tc到tt转换)，仅适用于生成所有可能的转变(嘌呤到嘌呤和嘧啶到嘧啶)突变的1/8。
7、(2)但是为避免细胞毒性，ddda被分裂为dddatoxn和dddatoxc两部分，两部分均由tale dna结合域引导到靶标位点，从而使得整个ddcbe质粒载体大小偏大，以水稻叶绿体ddcbe为例，组装完整用于植物转化的ddcbe质粒载体大小达到20kb，一方面增加组装难度和转化难度，另一方面限制了往ddcbe载体加入更多其他组件的潜力。
8、2、cydent细胞器胞嘧啶碱基编辑器，包含一对与foki切口酶、单链特异性胞苷脱氨酶和核酸外切酶融合的tale，该两个融合蛋白进一步在n端与细胞器转运肽融合。细胞器转运肽和tale阵列将融合蛋白靶向目标序列后，foki切口酶和核酸外切酶促使生成单链dna底物，单链特异性胞苷脱氨酶进一步催化单链dna的胞苷脱氨，最终以催化细胞器(线粒体和叶绿体)dna中的c·g到t·a的转化(hu等，2023)。
9、(1)但是cydent包含了tale(一对)、foki切口酶、单链特异性胞苷脱氨酶、核酸外切酶及ugi多个组分。这些组分由四个启动子驱动表达，这使得最终转化载体大小超过20kb，一方面增加载体组装难度和遗传转化难度，另一方面限制了往cydent载体加入更多其他组件的潜力。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供植物叶绿体和线粒体单体胞嘧啶碱基编辑器及其应用方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、本专利技术建立了适用植物(如水稻、玉米)叶绿体和线粒体基因组的单体胞嘧啶碱基编辑器，分别命名为单体叶绿体胞嘧啶碱基编辑器(monomeric chloroplast cytosinebase editor，mcpcbe)和单体线粒体胞嘧啶碱基编辑器(monomeric mitochondiacytosine base editor，mmtcbe)。
4、如图3，mcpcbe和mmtcbe均是含有转运肽、tale、单链特异性胞嘧啶脱氨酶sdd7、ddda全长e1347a突变体以及尿嘧啶糖基化酶抑制剂(ugi)的单一融合蛋白。mcpcbe和mmtcbe一方面具有高效c·g到t·a基因编辑能力，同时对底物dna序列上下文没有明显偏好性，克服了ddcbe的5'-tc序列基序依赖性；另一方面两者均为单体融合蛋白形式，结果紧凑，组装简化，相应植物转化载体大小在15kb以内。
5、如图3，本专利技术的核心组分是由sdd7与dddae1347a两个功能域融合形成的sdd7-dddae1347a新功能域，实现对双链dna的非5'-tc序列基序依赖性的胞嘧啶脱氨功能。
6、为克服ddda对底物dna 5'-tc序列基序依赖性：
7、本专利技术采用具有强大脱氨活性的单链特异性胞苷脱氨酶sdd7。sdd7可特异性对单链dna的胞嘧啶进行脱氨，其活性强于大鼠apobec1，同时对底物序列上下文没有明显偏好(huang等，2023)。
8、由于sdd7具有单链特异性，为了在碱基编辑靶位点区域形成单链作为sdd7脱氨底物，本专利技术将sdd7与dddae1347a突变蛋白融合，sdd7与dddae1347a之间是11aa的接头。dddae1347a的1347谷氨酸残基替换为丙氨酸残基，失去脱氨酶活性。sdd7与dddae1347a融合蛋白对双链dna具有胞嘧啶脱氨活性，可能是dddae1347a具有打开双链dna形成瞬间解链状态的功能，瞬间解链状态提供了sdd7的单链底物，从而实现胞嘧啶脱氨。
9、cho等也印证了dddae1347a具有打开双链dna形成瞬间解链状态功能的推测(cho等，2022)。...
【技术保护点】
1.植物叶绿体和线粒体单体胞嘧啶碱基编辑器，其特征在于：包括单体叶绿体胞嘧啶碱基编辑器和单体线粒体胞嘧啶碱基编辑器均是含有转运肽、TALE、单链特异性胞嘧啶脱氨酶Sdd7、DddA全长E1347A突变体以及尿嘧啶糖基化酶抑制剂的单一融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的植物叶绿体和线粒体单体胞嘧啶碱基编辑器，其特征在于：所述叶绿体单体胞嘧啶碱基编辑器和线粒体单体胞嘧啶碱基编辑器的细菌和植物双元表达载体，分别是pRL-mCpCBE和pRL-mMtCBE，叶绿体单体胞嘧啶碱基编辑器和线粒体单体胞嘧啶碱基编辑器，根据水稻密码子偏好性进行了密码子优化，它们在植物的表达由水稻Ubi启动子驱动，终止子为Nos终止子。
3.根据权利要求2所述的植物叶绿体和线粒体单体胞嘧啶碱基编辑器，其特征在于：所述pRL-mCpCBE和pRL-mMtCBE质粒载体具有可在大肠杆菌和农杆菌繁殖的复制子，以及筛选标记卡那霉素抗性基因，其中在TALE的NTD和CTD序列之间插入了毒蛋白基因ccdB，ccdB两侧提供了BsaI限制性核酸内切酶位点，pRL-mCpCBE和pRL-mMtCBE经Bs
4.叶绿体基因编辑和线粒体基因编辑的用途，其特征在于：包括单体叶绿体胞嘧啶碱基编辑器的N端转运肽为叶绿体转运肽，源自玉米叶绿体核酮糖二磷酸羧化酶小链基因转运肽，肽段长度为146aa；单体线粒体胞嘧啶碱基编辑器的N端转运肽为线粒体转运肽，源自水稻Rf1b细胞质雄性不育恢复基因转运肽，肽段长度为227aa。
5.植物叶绿体和线粒体单体胞嘧啶碱基编辑器的构建方法，其特征在于：包括以下方法，根据感兴趣的细胞器DNA靶位点序列设计TALE重复单元陈列，可委托商业公司组装TALE重复单元，组装好的重复单元阵列通过BsaI位点插入到pRL-mCpCBE和pRL-mMtCBE，即可完成载体构建。
6.植物叶绿体和线粒体单体胞嘧啶碱基编辑器系统的应用方法，其特征在于：包括以下方法，选取水稻、玉米等植物线粒体或叶绿体DNA靶标位置序列后，组装TALE重复单元插入到pRL-mCpCBE或pRL-mMtCBE质粒，完成载体构建，载体可转化农杆菌，用阳性农杆菌菌株进一步通过农杆菌浸染的方法转化植物；或通过基因枪转化方法直接将质粒载体转化植物，使其靶位点序列实现C-T的碱基编辑。
7.根据权利要求2所述的植物叶绿体和线粒体单体胞嘧啶碱基编辑器系统的应用方法，其特征在于：所述的碱基编辑系统的应用方法还包括，对转化后植物细胞器DNA进行抽提，然后利用针对靶点的特异性引物进行PCR扩增，利用细胞器DNA的PCR产物构建高通量二代DNA测序文库，并进行高通量二代DNA测序，所述的某物种的细胞器DNA靶点包括但不限于水稻的PsaA3和ATP6靶点中的至少一个。
...【技术特征摘要】
1.植物叶绿体和线粒体单体胞嘧啶碱基编辑器，其特征在于：包括单体叶绿体胞嘧啶碱基编辑器和单体线粒体胞嘧啶碱基编辑器均是含有转运肽、tale、单链特异性胞嘧啶脱氨酶sdd7、ddda全长e1347a突变体以及尿嘧啶糖基化酶抑制剂的单一融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的植物叶绿体和线粒体单体胞嘧啶碱基编辑器，其特征在于：所述叶绿体单体胞嘧啶碱基编辑器和线粒体单体胞嘧啶碱基编辑器的细菌和植物双元表达载体，分别是prl-mcpcbe和prl-mmtcbe，叶绿体单体胞嘧啶碱基编辑器和线粒体单体胞嘧啶碱基编辑器，根据水稻密码子偏好性进行了密码子优化，它们在植物的表达由水稻ubi启动子驱动，终止子为nos终止子。
3.根据权利要求2所述的植物叶绿体和线粒体单体胞嘧啶碱基编辑器，其特征在于：所述prl-mcpcbe和prl-mmtcbe质粒载体具有可在大肠杆菌和农杆菌繁殖的复制子，以及筛选标记卡那霉素抗性基因，其中在tale的ntd和ctd序列之间插入了毒蛋白基因ccdb，ccdb两侧提供了bsai限制性核酸内切酶位点，prl-mcpcbe和prl-mmtcbe经bsai消化后产生粘性末端，用于tale重复单元的安装。
4.叶绿体基因编辑和线粒体基因编辑的用途，其特征在于：包括单体叶绿体胞嘧啶碱基编辑器的n端转运肽为叶绿体转运肽，源自玉米叶绿体核酮糖二磷酸羧化酶小链基因转运肽，...
【专利技术属性】
技术研发人员：李日清，秦茂，刘敏，王学林，刘斌，李筠，李皓，李燕运，杨杰，柴昕岳，杨琼思，
申请(专利权)人：深圳市农业科技促进中心，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。