一种基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素检测系统及检测方法技术方案

技术编号：40421068 阅读：6 留言：0更新日期：2024-02-20 22:40

本发明专利技术涉及生物检测技术领域，具体为一种基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素检测系统及检测方法，本发明专利技术成功构建了一种功能性DNA引导的过渡态CRISPR/Cas12a微流控生物传感器FTMB。FTMB中的信号转导CRISPR/Cas12a策略利用具有特异性识别功能的DNA序列和激活剂来形成触发开关，同时通过调节crRNA和激活剂的组成比例，构建了过渡态CRISPR/Cas12a系统，以实现对低浓度目标真菌毒素的高响应。另一方面，FTMB的信号增强有效地集成了量子点的信号输出和光子晶体的荧光增强效应。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测，具体为一种基于crispr/cas12a的真菌毒素检测系统及检测方法。

技术介绍

1、真菌毒素被认为是引起食源性疾病的最重要原因之一，已受到全球的长期关注。其中，黄曲霉毒素b1(afb1)、赭曲霉毒素a(ota)、玉米赤霉烯酮(zen)、伏马菌素b1(fb1)、t-2真菌毒素(t-2)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)是最常见的毒素。随着公众健康意识的提高，一些组织已经设定了食品中真菌毒素的最大残留限量(mrls)，以避免高风险行为。然而，大多数真菌毒素都是微量存在的，这对食品安全构成了严重挑战。此外，多种真菌毒素共存于同一食品中的协同或拮抗作用增加了对人类的毒性。面对物流全球化的发展趋势，高效液相色谱法(hplc)和液相色谱-串联质谱法(lc-ms)等传统真菌毒素分析方法由于成本高、程序耗时、对专业技能的要求，在实际应用中受到限制。因此，迫切需要建立一种灵敏、快速、准确的多种真菌毒素高通量检测方法来满足当前的新需求。

2、到目前为止，已经报道了一些生物传感器用于真菌毒素的原位检测。特异性分子识别元件主要是抗体和适配体，与抗体相比，适配体具有合成容易、成本低、热稳定性好的优点，使其成为构建生物传感器的理想识别元件。通过指数富集配体的系统进化，已经筛选出多种真菌毒素适配体。由于适配体稳定的信号输出和可编程性，将适配体转化为荧光信号在生物传感器中具有更广泛的应用前景。然而，它主要用于真菌毒素的竞争免疫测定，因此，输出荧光强度与分析物浓度呈负相关，或通过二次信号处理呈正相关，这牺牲了检测精度。

<p>3、crispr/cas系统使真菌毒素和荧光信号之间建立直接的线性正相关成为可能。crispr-cas系统可以通过设计特定的引导rna链来实现与匹配的rna或dna的结合，成为基于这一特征的理想分子检测工具。crispr/cas12a系统基于cas12a酶，当功能性dna遇到目标分析物时，cas12a不加区分地切割周围的单链dna(ssdna)探针。此外，cas12a对crrna靶dna错配的内在耐受性较低，需要高度互补性，传感器在捕获目标分子时不受界面空间的限制，显著提高了识别效率。但是固相界面上的免疫识别受到比表面积、靶分子与界面之间缓慢扩散过程以及靶分子与固相界面非特异性相互作用的限制，cas12a酶的非特异性侧支切割活性限制了其在多靶点检测系统中的应用。因此，为了扩展crispr/cas12a系统的吞吐量检测策略，将其与多路复用微流控芯片相结合是一种可行的解决方案。

技术实现思路

1、本专利技术要解决的技术问题为：cas12a酶的非特异性侧支切割活性限制了其在多靶点检测系统中的应用，导致crispr/cas12a系统的检测通量小；同时crispr/cas12a系统中与分子识别事件相关的标签的信号强度低，导致检测灵敏度较低。

2、本专利技术为了实现对真菌毒素的高通量超灵敏检测，构建了一种功能性dna引导的过渡态crispr/cas12a微流控生物传感器(ftmb)，ftmb中的信号转导crispr/cas12a策略利用具有特异性识别功能的dna序列和激活剂来形成触发开关，同时通过调节crrna和激活剂的组成比例，构建了过渡态crispr/cas12a系统，以实现对低浓度目标真菌毒素的高响应。另一方面，ftmb的信号增强有效地集成了量子点(qds)的信号输出和光子晶体(pc)的荧光增强效应。

3、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：

4、本专利技术的第一个技术方案是：

5、一种基于crispr/cas12a的真菌毒素检测系统，所述的真菌毒素检测系统用于检测黄曲霉毒素b1(afb1)、赭曲霉毒素a(ota)、玉米赤霉烯酮(zen)、伏马菌素b1(fb1)、t-2真菌毒素(t-2)或者脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)中的任意一种或几种组合；

6、所述的检测系统中包括针对各个真菌毒素的以下物质：

7、4)适配体-1、激活子、适配体-2构成的复合物；

8、5)crrna；

9、6)探针；

10、其中，针对afb1，crrna的序列为：seq id no：1，适配体-1的序列为：seq id no：

11、2，激活剂的序列为：seq id no：3，适配体-2的序列为：seq id no：4；

12、针对ota，crrna的序列为：seq id no：5，适配体-1的序列为：seq id no：6，激活剂的序列为：seq id no：7，适配体-2的序列为：seq id no：8；

13、针对zen，crrna的序列为：seq id no：9，适配体-1的序列为：seq id no：10，激活剂的序列为：seq id no：11，适配体-2的序列为：seq id no：12；

14、针对fb1，crrna的序列为：seq id no：13，适配体-1的序列为：seq id no：14，激活剂的序列为：seq id no：15，适配体-2的序列为：seq id no：16；

15、针对t-2，crrna的序列为：seq id no：17，适配体-1的序列为：seq id no：18，激活剂的序列为：seq id no：19，适配体-2的序列为：seq id no：20；

16、针对don，crrna的序列为：seq id no：21，适配体-1的序列为：seq id no：22，激活剂的序列为：seq id no：23，适配体-2的序列为：seq id no：24。

17、优选的，探针两端分别被淬灭基团和荧光基团连接。

18、优选的，探针序列如seq id no:26所示。

19、优选的，探针连接于量子点的表面；所述的量子点是cdse/zns量子点。

20、优选的，所述的探针的制备方法是：

21、s1：称取edc和nhs溶于pb缓冲液中，加入量子点，活化、离心、洗涤、重悬，得到悬浊液；

22、s2：在所述悬浊液中加入ssdna报告分子，在超声条件下梯度混合至最终浓度，得到混合液；

23、s3：在所述混合液中加入额外edc，孵育、离心后收集产物，即为qd探针。

24、优选的，所述edc和nhs的浓度为1-5mg/ml；所述活化的时间为10-50min；所述洗涤和重悬的溶液为pbs缓冲液；所述梯度混合的梯度浓度为150-250nm，所述最终浓度为0.5-1.5μm；所述额外edc的浓度为10-30mg/ml；所述孵育的时间为1-3h。

25、优选的，所述的复合体是由适配体-1、激活剂、适配体-2的摩尔比1-5：1：1-5所构成，优选2:1:2。

26、优选的，所述的复合体的制备方法是每种真菌毒素的适配体-1、激活剂和适配体-2混合，将混合物加热，然后自然冷却至室温得到。

27、优选的，所述的检测系统中还本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素检测系统，其特征在于，所述的真菌毒素检测系统用于检测黄曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、伏马菌素B1(FB1)、T-2真菌毒素(T-2)或者脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)中的任意一种或几种组合；

2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素检测系统，其特征在于，所述探针两端分别被淬灭基团和荧光基团连接；所述探针序列如SEQ ID NO:26所示。

3.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素检测系统，其特征在于，所述探针连接于量子点的表面；所述的量子点是CdSe/ZnS量子点。

4.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素检测系统，其特征在于，所述的探针的制备方法是：

5.根据权利要求4所述的基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素检测系统，其特征在于，所述EDC和NHS的浓度为1-5mg/ml；所述活化的时间为10-50min；所述洗涤和重悬的溶液为PBS缓冲液；所述梯度混合的梯度浓度为

6.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12a的真菌毒素检测系统，其特征在于，所述的复合体是由适配体-1、激活剂、适配体-2的摩尔比1-5：1：1-5所构成，优选2:1:2；所述的复合体的制备方法是每种真菌毒素的适配体-1、激活剂和适配体-2混合，将混合物加热，然后自然冷却至室温得到；所述的检测系统中还包括Cas12a酶。

7.一种基于权利要求1所述的检测系统的检测真菌毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述的检测真菌毒素的方法，其特征在于，步骤1中，复合物的溶液的浓度是4-20nM，crRNA溶液的浓度是0.5-5μM，探针溶液的浓度是0.5-5μM，Cas12a酶的溶液的浓度是1-20μM；各个溶液的体积比依次是1.5:0.5-5:0.5-5:0.5-4。

9.根据权利要求7所述的检测真菌毒素的方法，其特征在于，所述的步骤2中，荧光强度还通过聚苯乙烯(PS)微球进行信号放大。

10.根据权利要求9所述的检测真菌毒素的方法，其特征在于，所述的聚苯乙烯(PS)微球的直径范围是250-550nm。

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【技术特征摘要】

1.一种基于crispr/cas12a的真菌毒素检测系统，其特征在于，所述的真菌毒素检测系统用于检测黄曲霉毒素b1(afb1)、赭曲霉毒素a(ota)、玉米赤霉烯酮(zen)、伏马菌素b1(fb1)、t-2真菌毒素(t-2)或者脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)中的任意一种或几种组合；

2.根据权利要求1所述的基于crispr/cas12a的真菌毒素检测系统，其特征在于，所述探针两端分别被淬灭基团和荧光基团连接；所述探针序列如seq id no:26所示。

3.根据权利要求1所述的基于crispr/cas12a的真菌毒素检测系统，其特征在于，所述探针连接于量子点的表面；所述的量子点是cdse/zns量子点。

4.根据权利要求1所述的基于crispr/cas12a的真菌毒素检测系统，其特征在于，所述的探针的制备方法是：

5.根据权利要求4所述的基于crispr/cas12a的真菌毒素检测系统，其特征在于，所述edc和nhs的浓度为1-5mg/ml；所述活化的时间为10-50min；所述洗涤和重悬的溶液为pbs缓冲液；所述梯度混合的梯度浓度为150-250nm，所述最终浓度为0.5-1.5μm；所述额外ed...

【专利技术属性】
技术研发人员：相欣然，陆佳冉，文千予，张乐妍，鞠晨，姜湘雲，陶梦荧，李婷，王其传，
申请(专利权)人：淮阴师范学院，
类型：发明
国别省市：

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