【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分析检测，尤其涉及一种液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法以及试剂盒。
技术介绍
1、人体体液内草酸浓度的检测方法包括氧化滴定法、比色法、原子吸收光谱法、酶分析法、极谱描记法、同位素稀释法、离子特异性电极法和各种色谱法等。其中，高效液相色谱法（hplc）凭借其灵敏度高、操作简单、重现性好等优势特点而倍受研究者的青睐。
2、目前，有关使用高效液相色谱法测定草酸的现有技术中，不乏已经使用高效液相色谱法来测定草酸的方案，比如专利cn104101679a以及文献《高效液相色谱法测定血和尿中的草酸》（张惠静,张世德,任建敏等.第三军医大学学报,1997(01):91-92.）等，均是以邻苯二胺和浓盐酸作为衍生试剂，与血和尿中草酸在高温（100～140℃）条件下反应生成具有强紫外吸收化合物2，3-二羟基喹喔啉，而后通过反相柱分离，从而进行血和尿中草酸的测定。但该方法存在衍生试剂稳定性差的问题，邻苯二胺和浓盐酸混合后保存时间较短，因此检测时需要现配现用，这不仅造成了衍生试剂的浪费，也一定程度上导致了使用的不便。
3、鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、针对上述技术问题，本专利技术意外发现，衍生试剂的稳定性差的原因与浓盐酸有关。后续通过大量研究后进一步发现，使用70~80wt%的磷酸水溶液和邻苯二胺作为衍生试剂时，不仅能够显著提升衍生试剂的稳定性，使其保存时间大大延长，还能大大降低衍生化反应的温度；同时，使用上述衍生试剂处理后还能提高草酸检测的加标回收
2、基于此，本专利技术具有如下技术方案：
3、第一方面，本专利技术首先提供液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法，包括：检测前对待测样品进行衍生处理，所述衍生处理包括：
4、将待测样品与衍生试剂混合，得到混合溶液；其中，所述衍生试剂包括邻苯二胺和70~80wt%的磷酸水溶液；
5、所述衍生试剂中，所述邻苯二胺和70~80wt%的磷酸水溶液的用量比为7~13 mg：1ml；所述待测样品与衍生试剂的体积比为7~9：1。
6、本专利技术发现，采用上述衍生化处理方法，能够显著提升衍生试剂的稳定性，大大延长衍生试剂的保存时间，还能降低衍生化反应的温度至80℃以下，使衍生化反应在水浴下即可实现；同时，使用上述衍生试剂处理后还能提高草酸检测的加标回收率，进一步提升了检测的准确度。
7、进一步优选地，所述磷酸水溶液的浓度为73~77wt%，可以选择73wt%、74wt%、75wt%、76wt%或77wt%。
8、进一步优选地，所述衍生试剂中，所述邻苯二胺和70~80wt%的磷酸水溶液的用量比为10 mg：1 ml。
9、作为优选，所述衍生处理的时间为0.75~1.5 h；进一步优选为1h。
10、进一步优选地，所述待测样品与衍生试剂的体积比为8：1。
11、作为优选，所述的液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法包括：将所述混合溶液进行离心，取上清液进行液相色谱检测。
12、本专利技术中，采用上述衍生化处理后，可以选择不调整衍生后产物的ph，而直接离心对上清液进行液相色谱检测，这对检测效果无影响。但考虑到长时间检测可能会对设备造成影响，也可以在衍生化处理后对ph进行调整。
13、本专利技术中，可以使用本领域检测草酸时的常规流动相，进一步优选地，使用以下流动相a和流动相b进行等度洗脱：流动相a为体积分数为0.05~0.15%的甲酸水溶液；流动相b为甲醇。
14、更进一步地，流动相a为体积分数为0.1%的甲酸水溶液。
15、作为优选，所述流动相a与所述流动相b的体积比为83~87：13~17，进一步优选为85：15。
16、作为优选，所述液相色谱检测使用的色谱柱为c18柱；进一步优选为c18 5μm 4.6×150mm。
17、作为优选，所述液相色谱检测中，进样量为5~20 μl。
18、作为本专利技术的一种优选实施方案，所述液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法包括如下步骤：
19、s1：衍生试剂配制
20、将邻苯二胺与70~80wt%的磷酸水溶液配制为7~13 mg/ml的衍生试剂，并在2~8℃保存；
21、具体实施中，本领域技术人员可以采用常规的配制方法，配制得到上述浓度的衍生试剂。如配制10 mg/ml的衍生试剂时，采用以下步骤：精确称取500 mg左右邻苯二胺，转移至50.00ml的容量瓶中，加一定量75wt%磷酸水溶液，盖上瓶塞防止渗漏，上下颠倒，超声至邻苯二胺完全溶解后，加75wt%磷酸定容至50.00ml，得10 mg/ml的衍生试剂。
22、上述浓度实际生产时可以进行等比例放大，具体步骤包括：以生产2.5 l样本萃取液为例，精确称取25 g邻苯二胺，转移至2.5 l的容量瓶中加一定量75wt%磷酸水溶液，盖上瓶塞防止渗漏，上下颠倒，超声至邻苯二胺完全溶解后，加75wt%磷酸水溶液定容至2.5 l。
23、s2：待测样品处理方法
24、1）将待测样品与所述衍生试剂混合，得到混合溶液，将所述混合溶液在60~80℃下衍生0.75~1.5 h；其中，所述待测样品与所述衍生试剂的体积比为7~9：1；
25、2）将衍生后的所述混合溶液在2~8℃、10000 rpm下离心5~10 min，上清液进行液相色谱检测；
26、具体实施过程中，本领域技术人员可以将所述上清液置于96孔u型板中，而后将96孔板置于液相中进行检测，在此不作限定。
27、s3：液相分析
28、色谱条件见表1：
29、表1
30、
31、本专利技术中，通过控制上述进样量，可适配不同灵敏度的仪器。
32、进一步优选地，流动相的流速为1 ml/min。
33、进一步优选地，自动进样器的条件参数包括：
34、进样模式：满环携带进样；注射泵速度：中速；进样针高度：2.5 mm；洗针次数：3次。
35、第二方面，本专利技术提供上述检测方法在诊断肾结石病症方面的应用。
36、草酸钙是最常见的结石，主要是由于体内钙和草酸水平之间的不平衡或缺乏足够的结晶抑制剂而形成的。尿草酸过多或高草酸尿症的原因可根据病因和临床表现的严重程度分为原发性（罕见）和继发性（常见）高草酸尿症。本专利技术利用高效液相色谱法实现对尿液中草酸浓度测定，辅助肾结石病症的诊断。
37、第三方面，本专利技术提供上述检测方法在制备试剂或试剂盒方面的应用。
38、第四方面，本专利技术提供一种用于实施上述检测方法的试剂盒，包括衍生试剂和待测样品；所述待测样品包括人尿液、校准品和质控品中的至少一种。
39、作为优选，所述试剂盒中还含有流动相。
40、作为优选，所述试剂盒中还含有甲醇和体积分数为0.05~0.15%的甲酸水本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法，其特征在于，包括：检测前对待测样品进行衍生处理，所述衍生处理包括：
2.根据权利要求1所述的液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法，其特征在于，所述衍生处理的时间为0.75~1.5 h。
3.根据权利要求1或2所述的液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法，其特征在于，包括：将所述混合溶液进行离心，取上清液进行液相色谱检测。
4.根据权利要求3所述的液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法，其特征在于，所述液相色谱检测包括使用流动相A和流动相B进行等度洗脱；其中，流动相A为体积分数为0.05~0.15%的甲酸水溶液；流动相B为甲醇。
5.根据权利要求4所述的液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法，其特征在于，所述流动相A与所述流动相B的体积比为83~87：13~17。
6.根据权利要求3所述的液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法，其特征在于，所述液相色谱检测使用的色谱柱为C18柱。
7.根据权利要求3所述的液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法，其特征在于，所述液相色谱检测中，进样量为5~2
8.一种用于实施权利要求1~7任一项所述检测方法的试剂盒，其特征在于，包括衍生试剂和待测样品；所述待测样品包括人尿液、校准品和质控品中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有甲醇和体积分数为0.05~0.15%的甲酸水溶液。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述校准品中草酸的浓度范围为10~250 μg/mL；所述质控品中草酸的浓度范围为30~187 μg/mL。
...【技术特征摘要】
1.一种液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法，其特征在于，包括：检测前对待测样品进行衍生处理，所述衍生处理包括：
2.根据权利要求1所述的液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法，其特征在于，所述衍生处理的时间为0.75~1.5 h。
3.根据权利要求1或2所述的液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法，其特征在于，包括：将所述混合溶液进行离心，取上清液进行液相色谱检测。
4.根据权利要求3所述的液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法，其特征在于，所述液相色谱检测包括使用流动相a和流动相b进行等度洗脱；其中，流动相a为体积分数为0.05~0.15%的甲酸水溶液；流动相b为甲醇。
5.根据权利要求4所述的液相色谱检测人尿液中草酸的检测方法，其特征在于，所述流动相a与所述流动相b的体积比为83~...
【专利技术属性】
技术研发人员：张新星，薛元强，栗琳，郑佳，丁沛瑜，苏营雪，周立，丁亮，
申请(专利权)人：北京豪思生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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