【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分析检测，尤其涉及同时检测人全血中叶酸和5-甲基四氢叶酸的检测方法。
技术介绍
1、叶酸是水溶性b族维生素，有促熟骨髓幼细胞的效果，且对人体细胞生长、蛋白质合成等具有重要作用。孕期妇女摄入叶酸，能有效减少新生儿唇裂、神经管畸形等新生儿出生缺陷的风险。
2、叶酸检测指标同时包括了几种叶酸形式(如四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、未代谢叶酸等)，5-甲基四氢叶酸是叶酸最具生物活性和功能的形式。红细胞总叶酸包括未代谢叶酸及其他代谢物。
3、目前叶酸的检测方法主要有：微生物检测法、比色法、同位素放射免疫法、色谱法和质谱法。微生物检测法、比色法、同位素放射免疫法均只能检测总叶酸，而质谱法在仪器和前处理方法上，成本较高。
4、例如现有技术中，cn112083108a公开了一种血液中叶酸的精准检测方法，其在样本前处理中采用了固相萃取的方式对叶酸进行富集净化，之后对净化液采用液相色谱串联质谱进行分析，其检测成本较高，操作繁琐。cn114646713a公开了一种叶酸及其代谢物的样本前处理方法以及检测方法，其也采用了固相萃取以及液相色谱串联质谱检测的方法，成本较高。
5、因此，如何提供一种成本较低、步骤简便的准确检测人全血中叶酸和5-甲基四氢叶酸的检测方法，成为本领域亟待解决的技术难题。
技术实现思路
1、为解决上述技术难题，本专利技术提供了一种同时检测人全血中叶酸和5-甲基四氢叶酸的检测方法，包括：
2、将待测样本与vc(l-抗坏血
3、将所述第一混合液与样本萃取液a和样本萃取液b混合，制得第二混合液；所述样本萃取液a为饱和硫酸锌溶液；所述样本萃取液b为体积比为(1～4)：(0.5～1.5)：1的甲醇、乙腈和异丙醇的混合液；样本萃取液a和样本萃取液b的体积比为1：(2～4)；
4、将所述第二混合液离心后，分离上清液进行液相色谱检测；
5、所述液相色谱检测的条件包括：
6、色谱柱为c18色谱柱；
7、流动相a为四丁基氢氧化铵磷酸盐缓冲液；流动相b为乙腈；
8、梯度洗脱程序如下：
9、洗脱过程中流动相a和流动相b的体积百分比之和为100％；
10、
11、本专利技术通过对各检测条件的组合进行大量优化试验后发现，选择硫酸锌作为红细胞裂解液，同时配合上述配比的甲醇、乙腈和异丙醇的混合液作为蛋白沉淀剂，对全血样本进行前处理，能够使得红细胞的裂解效果较好，充分释放待检叶酸及其衍生物，使得样本的萃取率较高；而且，通过控制样本萃取液a和样本萃取液b在上述体积比范围内时，能够使得萃取后的上清液清亮，避免呈棕色影响后续检测的准确性。
12、在液相色谱检测过程中，本专利技术发现选择四丁基氢氧化铵磷酸盐缓冲液作为反相色谱流动相时，配合乙腈作为另一流动相，在上述洗脱程序下，能够有效地解决叶酸液相峰拖尾、峰分裂等问题。
13、优选地，所述四丁基氢氧化铵磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾、磷酸、四丁基氢氧化铵甲醇溶液的混合水溶液。
14、优选地，每1l所述四丁基氢氧化铵磷酸盐缓冲液中含有1～3g磷酸二氢钾、500～800μl75％磷酸、以及2～5ml40％四丁基氢氧化铵甲醇溶液。
15、优选地，每200μl待测样本中加入0.01g～0.03g的vc。
16、vc在本专利技术中作为保护剂。
17、优选地，待测样本与样本萃取液a的体积比为(3～5)：1。
18、优选地，所述色谱柱为svea tm hplc column c18色谱柱，其规格为5μm、
19、或所述色谱柱为pursuit xrs 5c18色谱柱，其规格为150×4.6mm。
20、优选地，所述色谱柱的柱温为38～42℃；和/或，所述流动相a和b的流速为0.6～1.2ml/min。
21、优选地，在液相色谱检测后采用紫外检测器串联荧光检测器进行检测。
22、由于叶酸检测一般采用紫外检测器，其荧光较弱，而5-甲基四氢叶酸一般采用荧光检测器，紫外无法很好检测。故优选检测采用紫外检测器串联荧光检测器的方法，对两种化合物分别进行检测。
23、此外，采用液相色谱法检测叶酸时，通常会选择其结构类似物(例如氨基喋呤或亚叶酸)作为内标，但是本专利技术发现氨基喋呤或亚叶酸作为内标时，无法同时满足紫外检测器及荧光检测器对叶酸和5-甲基四氢叶酸进行校正，且全血基质复杂，增加另外的待测物，会增加实验的复杂性。而本专利技术的检测方法经过性能验证后发现，确定可不引入内标。
24、优选地，紫外检测器的波长为280～285nm；荧光检测器的激发光波长为292～298nm，发射光波长为358～364m。
25、优选地，将所述第二混合液离心后，将分离的上清液经过0.22μm滤膜过滤后进行液相色谱检测。
26、通过滤膜过滤能够使得待检测上清液更干净，进一步提高检测结果的准确性。
27、优选地，将所述第二混合液离心后取上清液进行二次离心后，分离上清液进行液相色谱检测。
28、优选地，还包括：采用所述检测方法检测质控品和/或标准品，所述质控品和/或标准品的配制过程中采用兔全血作为稀释剂。
29、本专利技术还发现，在配制质控品或标准品时，选择兔全血作为稀释剂能够在采用上述检测方法检测时通过基质效应实验，待测物的稳定性较好。
30、与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
31、本专利技术提供了一种成本较低、步骤简便、且能很好分离全血样本中未代谢叶酸及其代谢产物5-甲基四氢叶酸的检测方法，该方法能满足验证过程中对精密度、准确度和基质效应等方面的要求，而且本专利技术的检测方法可在不引入内标的情况下实现准确检测的效果，该方法对于评价全血样本中叶酸及其代谢产物含量具有重要作用。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种同时检测人全血中叶酸和5-甲基四氢叶酸的检测方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，每200μL待测样本中加入0.01g～0.03g的Vc。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，待测样本与样本萃取液A的体积比为(3～5)：1。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱为Svea TM HPLC ColumnC18色谱柱，其规格为5μm、
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为38～42℃；和/或，所述流动相A和B的流速为0.6～1.2mL/min。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在液相色谱检测后采用紫外检测器串联荧光检测器进行检测。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，紫外检测器的波长为280～285nm；荧光检测器的激发光波长为292～298nm，发射光波长为358～364m。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，将所述第二混合液离心后，将分离的上清液经过0.22μm滤
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，将所述第二混合液离心后取上清液进行二次离心后，分离上清液进行液相色谱检测。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，还包括：采用所述检测方法检测质控品和/或标准品，所述质控品和/或标准品的配制过程中采用兔全血作为稀释剂。
...【技术特征摘要】
1.一种同时检测人全血中叶酸和5-甲基四氢叶酸的检测方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，每200μl待测样本中加入0.01g～0.03g的vc。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，待测样本与样本萃取液a的体积比为(3～5)：1。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱为svea tm hplc columnc18色谱柱，其规格为5μm、
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为38～42℃；和/或，所述流动相a和b的流速为0.6～1.2ml/min。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在液相色...
【专利技术属性】
技术研发人员：张新星，郑佳，栗琳，薛元强，应洪波，苏营雪，丁沛瑜，周立，丁亮，
申请(专利权)人：北京豪思生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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