【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因检测领域，具体涉及用于非洲绿猴细胞(vero细胞)残留dna含量检测的引物组和探针组合物、实时荧光定量pcr试剂盒、检测方法及应用。
技术介绍
1、vero细胞是一种从非洲绿猴(cercopithecus aethiops)的肾脏上皮中分离培养出的异倍体细胞系。自vero细胞系诞生后，其广泛用于多种病毒性疫苗的制备，如狂犬病疫苗和轮状病毒疫苗等。vero细胞作为一种传代细胞系，易于培养，适合大规模工艺生产，是世界卫生组织(who)重点推荐的人用疫苗细胞基质之一。
2、vero细胞作为生物制品的一种生产介质，除了支持目的产物(如重组蛋白)的生产外，其残余的生物遗传物质dna是一个非常重要的污染。理论上，存在于生物制品中的微量dna杂质都有可能导致癌变或其他病毒变化，因此需要对生物制品中的dna杂质进行严格检测从而保证良好的质量控制。目前，who推荐的标准是每剂量制品中的终dna含量必须小于10ng，美国fda建议使用检测灵敏度达到10pg的检测方法检测制品中的dna水平，我国药典规定每剂量疫苗中的vero细胞dna残留量必须少于3ng/剂量。
3、目前检测rcdna含量的方法有斑点杂交法、荧光染色法及qpcr法。
4、荧光染色法的优势在于其易用性和低成本，对于含dna水平较高的样品(如上游生物过程样本)具有一定的实用性，但其灵敏度较低，最低检测限仅为0.2ng；阈值法检测rcdna的灵敏度达1～3pg，但其成本相对较高，通量低，dna片段小于600bp无法检出。
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6、上述这两种方法都难以满足vero细胞dna残留检测要求。与这两种方法相比，qpcr法具有特异性好、灵敏度高和操作简单的优点，已逐渐成为检测宿主细胞dna残留的首选方法。但是稳定的qpcr方法建立需要在靶向基因的选择(高丰度且保守)、引物/探针设计(退火温度及gc含量)、检测体系优化和所扩增条带的大小(扩增效率)等方面综合考虑，否则所建立的qpcr法在实际的检测过程中会有一些不足，如特异性不够好，扩增效率不高和重复性不好等问题。
技术实现思路
1、为了克服现有技术中的不足，本专利技术提供了一种基于实时荧光定量pcr检测vero细胞残留dna的引物探针组合物、试剂盒、方法及应用。
2、针对特定的宿主细胞采用的qpcr目标序列主要为高度保守的管家基因序列，如β-actin，或者是重复序列，如鼠的l1序列，卫星序列，16s或18s rrna基因等。kpni家族基因是vero细胞中具有高度重复序列特征和种属特异性的一种基因，适于作为实时定量检测用的靶基因。本专利技术选取kpni家族基因中的一段序列，即kpni-ret(genbank登录号：koo550.1)设计荧光定量pcr检测用引物及相应的探针。为评估狂犬病毒灭活疫苗(vero细胞)rcdna含量，本专利技术的方法采用磁珠法提取宿主细胞dna，结合qpcr法建立适用于狂犬病毒灭活疫苗(vero细胞)rcdna的检测方法，并对方法进行验证及初步应用。
3、本专利技术解决技术问题的技术方案如下：
4、在本专利技术的第一方面，提供了一种基于实时荧光定量pcr检测vero细胞残留dna的引物探针组合物，包括引物和探针，选自下列三种组合物中的任意一种：
5、1)所述的引物和探针：分别为根据vero细胞全基因组的kpni-ret基因设计正向引物kpni-f、反向引物kpni-r和探针kpni-p，其核苷酸序列依次如seq id no：1-3所示；
6、2)所述的引物和探针，其序列分别为与上述第1)组中如seq id no：1-3所示的序列相比，有不超过4个核苷酸的置换、缺失或添加的序列；
7、3)所述的引物和探针，其序列分别为与上述第1)组中如seq id no：1-3所示的序列相比，具有85％-99.99％的序列同源性，且与如seq id no：1-3所示的序列具有相同的功能。
8、优选地，所述探针kpni-p两端分别标记有荧光基团和淬灭基团，并且与扩增片段的中间部分序列同源。
9、优选地，所述荧光基团为fam，淬灭基团为bhq1。
10、在本专利技术的第二方面，提供了含有第一方面所述引物探针组合物的试剂盒。所述的试剂盒可以用于检测vero细胞残留dna。
11、优选地，所述的试剂盒包括dntp混合物、mg2+离子、taq dna聚合酶、引物探针组合物、10×pcr buffer、阳性对照和阴性对照，其中阳性对照为vero细胞dna标准品，阴性对照为ddh2o。
12、在本专利技术的第三方面，提供了应用如第一方面所述引物探针组合物或如第二方面所述试剂盒检测vero细胞残留dna的方法，包括以下步骤：
13、1)核酸提取：提取待测细胞样本dna；
14、2)制备反应体系：制备30μl定量pcr反应体系，制备30μl定量pcr反应体系，包括dna、dntp混合物、mg2+离子、taq dna聚合酶、正向引物、反向引物、探针、10×pcr buffer和水；
15、3)反应程序：包括95℃预变性5分钟；95℃变性30秒、60℃退火延伸90秒，40个循环；
16、4)结果检测：包括实时荧光信号判读、绘制标准曲线；该方法不用于疾病的诊断与治疗。
17、优选地，所述定量pcr反应体系中，各组分的浓度或用量如下：2.5mm dntp混合物3.0μl、50mm mg2+离子1.5μl、4u taq dna聚合酶0.4μl、正向引物和反向引物终浓度各15um、探针终浓度为10um、10×pcr buffer 3μl、dna 10μl，余量用去离子水补足30μl。
18、在本专利技术的第四方面，提供了如第一方面所述引物探针组合物或如第二方面所述试剂盒或如第三方面所述的检测方法在检测vero细胞残留dna中的应用，所述的应用为非疾病诊断目的。
19、本专利技术的有益效果如下：
20、kpni家族基因是vero细胞中具有高度重复序列特征和种属特异性的一种基因，适于作为实时定量检测用的靶基因。本专利技术所采用qpcr法，即选取kpni家族基因中的一段序列，即kpni-ret(genbank登录号：koo550.1)设计荧光定量pcr检测用引物及相应的探针。考虑到疫苗成品制剂规格一般为0.5ml/人份，其对应的实际样品检测最低限度为125pg/剂量，我国药典对vero细胞生产的疫苗制剂的残留量为100pg/剂，因此需要开发更加灵敏和稳定的检测方法。
21、专利技术人根据kpni-ret基因的dna保守序列，按照80～120bp扩增产物分别设计出多套扩增引物和探针的组合物，作为核心设计原则，并兼顾探针退火温度高于引物10℃、gc含量在55％左右的设计思路本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于实时荧光定量PCR检测Vero细胞残留DNA的引物探针组合物，包括引物和探针，其特征在于，选自下列三种组合中的任意一种：
2.根据权利要求1所述的基于实时荧光定量PCR检测Vero细胞残留DNA的引物探针组合物，其特征在于，所述探针KPNI-P两端分别标记有荧光基团和淬灭基团，并且与扩增片段的中间部分序列同源。
3.根据权利要求2所述的基于实时荧光定量PCR检测Vero细胞残留DNA的引物探针组合物，其特征在于，所述荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1。
4.含有如权利要求1-3任意一项所述引物探针组合物的试剂盒。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括dNTP混合物、Mg2+离子、Taq DNA聚合酶、引物探针组合物、10×PCR Buffer、阳性对照和阴性对照，其中阳性对照为Vero细胞DNA标准品，阴性对照为ddH2O。
6.应用如权利要求1所述引物探针组合物或如权利要求4所述试剂盒检测Vero细胞残留DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的
8.如权利要求1所述引物探针组合物或如权利要求4所述试剂盒在检测Vero细胞残留DNA中的应用，所述的应用为非疾病诊断目的。
...【技术特征摘要】
1.一种基于实时荧光定量pcr检测vero细胞残留dna的引物探针组合物，包括引物和探针，其特征在于，选自下列三种组合中的任意一种：
2.根据权利要求1所述的基于实时荧光定量pcr检测vero细胞残留dna的引物探针组合物，其特征在于，所述探针kpni-p两端分别标记有荧光基团和淬灭基团，并且与扩增片段的中间部分序列同源。
3.根据权利要求2所述的基于实时荧光定量pcr检测vero细胞残留dna的引物探针组合物，其特征在于，所述荧光基团为fam，淬灭基团为bhq1。
4.含有如权利要求1-3任意一项所述引物探针组合物的试剂盒。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括dntp混合物、mg2+离子、taq dna聚合酶、引物探针组合物、10×pcr b...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱寅彪，夏进涛，戴蕾，李若男，王文忠，
申请(专利权)人：江苏金迪克生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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