【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于木质素加工，尤其涉及一种制备能够促进生物转化的羧甲基化木质素的方法与应用。
技术介绍
1、木质素是自然界存量最广泛的可再生芳香族资源，应用范围较广。目前，木质素在工业中的使用率还不是很高，如果要直接使用，则需要先对其进行一定的改性处理。木质素是无定型聚合物，分子量较低且结构复杂，分子中可反应基团的活性较低，通过化学法生产木质素增值产品时，通常需要较高的反应条件(如高温高压，或者特定的催化体系)以保证反应效率和产量，且木质素的异质性也会影响解聚单体的选择性，这些因素会带来更高的成本和能耗。而通过生物转化来提高木质素的基团反应活性时，由于生物转化培养条件温和，产物价值高，且菌体中具有“生物漏斗”途径，因此，在克服木质素异质性的难题上具有优势，使得通过生物转化生产木质素高价值产品成为研究的一大热点。
2、发酵通常在水相培养基中进行。木质素在水中的分散性对其生物转化效率有重要影响。一方面，未改性的玉米秸秆木质素在水中溶解度较差，构型紧凑，不利于微生物解聚利用。另一方面，由于恶臭假单胞菌利用木质素生产pha在液体培养基当中进行，普通木质素较差的水溶性是菌对其利用效率以及pha产量均低的原因之一。另外，pha的生物合成通常需要限制氮源，且需要充足的碳源供应。因此，如何通过提高木质素在水中的分散性以改善木质素在发酵液中的溶解情况，提高发酵效果和pha产量，同时保证低成本和低能耗，是当前木质素高值化研究中的一个重大难题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提
2、为实现上述目的，本专利技术提供了以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种制备羧甲基化木质素的方法，包括如下步骤：
4、(1)将玉米秸秆与稀硫酸溶液混合，灭菌，获得酸处理秸秆；
5、(2)将步骤(1)获得的酸处理秸秆与氢氧化钠溶液混合，热处理，调节ph至2～3，真空冷冻干燥，获得酸碱木质素；
6、(3)将酸碱木质素与苯酚混合，加入浓硫酸进行酚化反应，获得酚化木质素；
7、(4)将酚化木质素与氢氧化钠混合，加热至50～70℃，加入甲醛，调节ph至2～3，真空冷冻干燥，获得羟甲基化木质素；
8、(5)依次将异丙醇、氢氧化钠加入羟甲基化木质素中，加入氯乙酸，调节ph至6～7，真空冷冻干燥，获得羧甲基化木质素。
9、优选的，步骤(1)所述玉米秸秆与稀硫酸溶液的质量体积比为90～100g:1l；所述稀硫酸的质量浓度为0.5～1.5％；所述灭菌的温度为121±5℃，所述灭菌的时间为20～40min。
10、优选的，步骤(2)所述氢氧化钠的质量浓度为0.5～1.5％；所述热处理的温度为121±5℃，所述热处理的时间为0.5～1.5h；所述真空冷冻干燥的温度为-40～-60℃，所述真空冷冻干燥的时间为34～38h。
11、优选的，步骤(3)所述酸碱木质素与苯酚的质量比为1:2～3；所述酸碱木质素与浓硫酸的质量体积比为7～8g:1ml，所述浓硫酸的质量浓度为70～75％。
12、优选的，步骤(4)所述酚化木质素与氢氧化钠的质量体积比为1g:8～10ml，所述氢氧化钠的体积摩尔浓度为2～3mol/l；所述甲醛的添加量为氢氧化钠用量的2～3倍；所述真空冷冻干燥的温度为-40～-60℃，所述真空冷冻干燥的时间为22～26h。
13、优选的，步骤(5)所述羟甲基化木质素与异丙醇的质量体积比为1g:50～60ml，所述羟甲基化木质素与氢氧化钠的质量比为1:3～4；所述氯乙酸的添加次数为2～3次，每次的添加量与羟甲基化木质素的用量相同；所述真空冷冻干燥的温度为-40～-60℃，所述真空冷冻干燥的时间为22～26h。
14、本专利技术还提供了所述方法制备获得的羧甲基化木质素在制备高产聚羟基脂肪酸酯中的应用。
15、本专利技术还提供了一种制备聚羟基脂肪酸酯的方法，包括如下步骤：
16、将羧甲基化木质素按质量体积比为0.3～0.5g:1l加入培养基中，调节ph至12～13，离心，调节ph至6～7，加入种子液，25～35℃恒温震荡培养，获得聚羟基脂肪酸酯。
17、优选的，所述培养基为m9矿物培养基，所述培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：5～6g/l na2hpo4，2～3g/l kh2po4，0.5～1g/l nacl，0.1～0.15g/l mgso4，40～50mg/lnh4cl，0.5～1g/l苯甲酸钠和1～1.5ml/l微量元素溶液。
18、优选的，所述离心的转速为8000～9000rpm，所述离心的时间为3～5min，所述恒温震荡培养的转速为100～200rpm，所述恒温震荡培养的时间为48～60h。
19、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
20、本专利技术通过pearson相关性系数和vpa方差分解分析发现，羧甲基化改性引入的亲水性基团cooh与木质素发酵效果存在强相关关系，且与pha产量变化存在极显著相关。但是亲水基团对发酵效果的影响并不是单独发挥作用的，发酵效果同时还受到mn值的影响，更低的分子量有助于提高p.putida kt2440发酵效果。
21、gpc结果显示，cmhpl的多分散性较高，含有更多的小分子量木质素片段，有利于微生物的转化利用。
22、溶解性测试结果表明，胺化木质素(al)和羧甲基化木质素(cmhpl)在培养基当中的溶解情况均得到改善，溶解度分别为97.7％和98.7％，是cl的1.09倍和1.10倍。去甲基化木质素(dl)溶解度则降低，可能是由于强酸的反应体系反而导致了木质素结构缩合，水溶性下降。
23、spearman相关性系数分析结果表明，亲水性基团(cooh和oh)对phac基因的表达存在显著的正相关。发酵过程中，四种木质素的连接结构以及木质素单元相关信号强度均有不同程度的下降，证明p.putida kt2440对改性木质素底物的成功转化。其中，羧甲基化木质素在活菌数量及pha产量方面均最高。相应地，其pha合成关键功能基因表达在24h时达到最大表达量，显著高于同时段的其他木质素材料发酵培养基中的功能基因表达情况。证明羧甲基化木质素是更优良的p.putida kt2440产pha发酵原料，为提高木质素生物转化效率，生产高价值产品提供一定的依据和参考。
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1.一种制备羧甲基化木质素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述玉米秸秆与稀硫酸溶液的质量体积比为90～100g:1L；所述稀硫酸的质量浓度为0.5～1.5％；所述灭菌的温度为121±5℃，所述灭菌的时间为20～40min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述氢氧化钠的质量浓度为0.5～1.5％；所述热处理的温度为121±5℃，所述热处理的时间为0.5～1.5h；所述真空冷冻干燥的温度为-40～-60℃，所述真空冷冻干燥的时间为34～38h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述酸碱木质素与苯酚的质量比为1:2～3；所述酸碱木质素与浓硫酸的质量体积比为7～8g:1mL，所述浓硫酸的质量浓度为70～75％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述酚化木质素与氢氧化钠的质量体积比为1g:8～10mL，所述氢氧化钠的体积摩尔浓度为2～3mol/L；所述甲醛的添加量为氢氧化钠用量的2～3倍；所述真空冷冻干燥的温度为-40～-
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述羟甲基化木质素与异丙醇的质量体积比为1g:50～60mL，所述羟甲基化木质素与氢氧化钠的质量比为1:3～4；所述氯乙酸的添加次数为2～3次，每次的添加量与羟甲基化木质素的用量相同；所述真空冷冻干燥的温度为-40～-60℃，所述真空冷冻干燥的时间为22～26h。
7.如权利要求1～6任一项所述方法制备获得的羧甲基化木质素在制备高产聚羟基脂肪酸酯中的应用。
8.一种制备聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述培养基为M9矿物培养基，所述培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：5～6g/L Na2HPO4，2～3g/L KH2PO4，0.5～1g/L NaCl，0.1～0.15g/L MgSO4，40～50mg/L NH4Cl，0.5～1g/L苯甲酸钠和1～1.5mL/L微量元素溶液。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述离心的转速为8000～9000rpm，所述离心的时间为3～5min，所述恒温震荡培养的转速为100～200rpm，所述恒温震荡培养的时间为48～60h。
...【技术特征摘要】
1.一种制备羧甲基化木质素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述玉米秸秆与稀硫酸溶液的质量体积比为90～100g:1l；所述稀硫酸的质量浓度为0.5～1.5％；所述灭菌的温度为121±5℃，所述灭菌的时间为20～40min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述氢氧化钠的质量浓度为0.5～1.5％；所述热处理的温度为121±5℃，所述热处理的时间为0.5～1.5h；所述真空冷冻干燥的温度为-40～-60℃，所述真空冷冻干燥的时间为34～38h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述酸碱木质素与苯酚的质量比为1:2～3；所述酸碱木质素与浓硫酸的质量体积比为7～8g:1ml，所述浓硫酸的质量浓度为70～75％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述酚化木质素与氢氧化钠的质量体积比为1g:8～10ml，所述氢氧化钠的体积摩尔浓度为2～3mol/l；所述甲醛的添加量为氢氧化钠用量的2～3倍；所述真空冷冻干燥的温度为-40～-60℃，所述真空冷冻干燥的时间为22～26h。
【专利技术属性】
技术研发人员：赵志敏，李逸冰，张彤彤，孟榕倩，巩志群，
申请(专利权)人：内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：
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