【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病原微生物检测，尤其涉及一种基于crispr/cas12a-rpa快速检测水稻细菌性条斑病菌的序列组合及应用，具体地是一种基于crispr/cas12a-rpa快速检测水稻细菌性条斑病菌的序列组合、检测试剂盒、检测方法和应用。
技术介绍
1、水稻细菌性条斑病是一种由水稻黄单胞菌引起的细菌性病害，严重破坏水稻产量。水稻细菌性条斑病分布于亚洲的热带和亚热带，西非和东非地区；在我国，主要分布于华中、华南和西南地区。水稻细菌性条斑病在我国南方已经多次被报道，其导致水稻产量损失10%-20%，有时甚至损失高达40%，甚至绝收，严重威胁水稻生产安全。在出现明显的症状之前，早期感染水稻细菌性条斑病菌的水稻，难以通过非专业知识进行物理诊断，导致水稻细菌性条斑病的爆发引起水稻作物的大量死亡。因此，通过分子技术在水稻种子带菌阶段或者在水稻幼苗期检测到这种病害，对于水稻的生产，农民的增收有着重要的意义。
2、目前，检测水稻细菌性条斑病的方法主要是传统的检测方法和近些年发展的分子检测技术等。传统的检测方法主要有噬菌体检测法、育苗生长观察法、致病性测定、直接分离法、血清学检测技术等；近些年发展的分子检测技术主要有：普通pcr、数字pcr、荧光定量pcr法等。传统的检测方法耗时长，检测不方便，并且需要专门的技术人员进行检测。目前，我国检测水稻细菌性条斑病的国家标准是基于含铁细胞接受因子基因利用pcr技术来检测。
3、crispr/cas（簇状规则间隔短回文重复序列/crispr相关）是细菌和古细菌等原核生物中一种自然发
技术实现思路
1、针对上述问题，本专利技术提供是一种基于crispr/cas12a-rpa快速检测水稻细菌性条斑病菌的序列组合及应用，具体地是一种基于crispr/cas12a技术结合rpa技术快速检测水稻细菌性条斑病菌的序列组合、检测试剂盒、检测方法和应用，具有特异性好、灵敏度高、简单快速、样本要求低、高效等特点，可以实现在田间快速检测的要求，提高了检测效率，为水稻细菌性条斑病菌的检测方法提供一种新的选择。
2、为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案为：
3、一种基于crispr/cas12a-rpa快速检测水稻细菌性条斑病菌的序列组合，包括根据 avrrxo1基因设计的rpa引物对序列、crrna序列和ssdna探针序列；
4、其中，rpa引物对序列为：
5、正向引物rpa-avrrxo1-f2的序列为：5’-ccgaccggtttgaaggcggacttcgctctc-3’（seq id no：1）；
6、反向引物rpa-avrrxo1-r2的序列为：5’-cctgtctatcacgtacattctattgctccg-3’（seq id no：2）；
7、crrna序列为：uaauuucuacuaaguguagaugcugcaaaacucccaccaaagaa（seq id no：3）；
8、所述ssdna探针序列是用于荧光定量pcr仪器检测的水稻细菌性条斑病菌的ssdna探针序列、用于可视化荧光检测的水稻细菌性条斑病菌的ssdna探针序列或用于侧流层析试纸条检测的水稻细菌性条斑病菌的ssdna探针序列。
9、进一步的，用于荧光定量pcr仪器检测的水稻细菌性条斑病菌的ssdna探针序列为ssdna-reporter-fam或ssdna-reporter-cy5；
10、其中，ssdna-reporter-fam为：5’-fam-ttatt-bhq1-3’；
11、ssdna-reporter-cy5为：5’-cy5-tgtcttatcccccataagaca-bhq1-3’；
12、用于可视化荧光检测的水稻细菌性条斑病菌的ssdna探针序列为ssdna-reporter-fam-2，具体为：5’-fam-tgtcttatcccccataagaca-bhq1-3’；
13、用于侧流层析试纸条检测的水稻细菌性条斑病菌的ssdna探针序列为fb-reporter，具体为：5’-fam-ttttttttt-biotin-3’。
14、一种快速检测水稻细菌性条斑病菌的检测试剂盒，所述试剂盒包含rpa引物对序列、crrna序列和ssdna探针序列。
15、进一步的，所述试剂盒还包含rehydration buffer、mgoac、酶干粉、lbcas12a和ddh2o；
16、所述酶干粉用于rpa反应。
17、进一步的，所述试剂盒含有多个独立单元的八连排pcr反应管，所述pcr反应管中含有酶干粉；
18、所述试剂盒包括用于进行rpa扩增反应的反应体系和用于进行crispr/cas12a反应的体系。
19、进一步的，用于进行rpa扩增反应的反应体系的总体积为50μl，反应体系中包括：正向引物rpa-avrrxo1-f1、反向引物rpa-avrrxo1-r1、rehydration buffer、ddh2o和模板dna，混匀后迅速放入含有冻干酶粉的pcr反应管中，将冻干酶粉溶解后，最后加入mgoac；其中，模板dna即为对待测样本提取获得；
20、具体的用于进行rpa扩增反应的反应体系为：2.4μl浓度为10μm的正向引物rpa-avrrxo1-f1、2.4μl浓度为10μm的反向引物rpa-avrrxo1-r1、29.5μl的rehydrationbuffer、11.2μl的ddh2o、2μl模板dna，混匀后迅速放入含有冻干酶粉的pcr反应管中，将冻干酶粉溶解后，最后加入2.5μl的mgoac；
21、用于进行crispr/cas12a反应的体系总体积为20μl；用于进行crispr/cas12a反应的体系为用于进行rpa/cas12a荧光检测的反应体系、用于进行rpa/cas12a可视化荧光检测的反应体系或者用于进行rpa/cas12a-lfa反应的反应体系；所述体系选自如下任一种：
22、用于进行rpa/cas12a荧光检测的体系包括：sf缓冲液、crrna、rna酶抑制剂、ssdna-reporter-cy5或者ssdna-reporter-fam-2、lbcas12a、rpa扩增产物和depc处理水；具体的是：2μ本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于CRISPR/Cas12a-RPA快速检测水稻细菌性条斑病菌的序列组合，其特征在于，包括根据avrRxo1基因设计的RPA引物对序列、crRNA序列和ssDNA探针序列；
2.一种快速检测水稻细菌性条斑病菌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的RPA引物对序列、crRNA序列和ssDNA探针序列。
3.根据权利要求2所述的一种快速检测水稻细菌性条斑病菌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含Rehydration Buffer、MgOAC、酶干粉、LbCas12a酶和ddH2O；
4.根据权利要求2或3所述的一种快速检测水稻细菌性条斑病菌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于进行RPA扩增反应的反应体系和用于进行CRISPR/Cas12a反应的体系。
5.根据权利要求4所述的一种快速检测水稻细菌性条斑病菌的检测试剂盒，其特征在于，用于进行RPA扩增反应的反应体系的总体积为50μL，反应体系包括：正向引物RPA-avrRxo1-F1、反向引物RPA-avrRxo1-R1、Rehydration b
6.权利要求2-5中任一项所述的一种快速检测水稻细菌性条斑病菌的检测试剂盒在检测田间水稻细菌性条斑病菌中的应用。
7.一种快速检测水稻细菌性条斑病菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的一种快速检测水稻细菌性条斑病菌的检测方法，其特征在于，
9.权利要求7或8所述的一种快速检测水稻细菌性条斑病菌的检测方法在水稻细菌性条斑病菌检测方面的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基于crispr/cas12a-rpa快速检测水稻细菌性条斑病菌的序列组合，其特征在于，包括根据avrrxo1基因设计的rpa引物对序列、crrna序列和ssdna探针序列；
2.一种快速检测水稻细菌性条斑病菌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的rpa引物对序列、crrna序列和ssdna探针序列。
3.根据权利要求2所述的一种快速检测水稻细菌性条斑病菌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含rehydration buffer、mgoac、酶干粉、lbcas12a酶和ddh2o；
4.根据权利要求2或3所述的一种快速检测水稻细菌性条斑病菌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于进行rpa扩增反应的反应体系和用于进行crispr/cas12a反应的体系。
5.根据权利要求4所...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵辉，张海敏，杜晓希，胡帅，张金鑫，纪长绵，夏启玉，郭安平，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院三亚研究院，
类型：发明
国别省市：
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