【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于制剂检测，具体涉及检测注射用重组人凝血因子ⅷ效价的方法。
技术介绍
1、血友病是一组由于血液中某些凝血因子的缺乏而导致患者产生严重凝血障碍的遗传性出血性疾病，男女均可发病。按照缺乏的凝血因子类型，常见血友病分为甲、乙、丙型3种，分别由凝血因子ⅷ、凝血因子ⅸ和凝血因子ⅺ缺乏引起。其中甲型血友病在临床上最常见，约占血友病人数的80～85％。目前，静脉注射人凝血因子ⅷ生物制品进行替代治疗是甲型血友病患者的主要治疗手段。由于凝血因子ⅷ的广泛应用，ⅷ因子的效价检测成为科学家关注的重点。无论哪种产品，人凝血因子ⅷ的效价都是产品放行的关键指标。
2、与血源性fviii制品相比，重组人凝血因子ⅷ制品不受限于血浆，且整个生产过程中不添加任何血源性成份，在安全性、有效性等方面都有了很大程度的提高，应用前景广阔。准确检测重组人凝血因子ⅷ制品中的重组人凝血因子ⅷ效价具有重要意义。
3、目前报道的测定注射用人凝血因子ⅷ生物制品效价的方法主要为凝固法、显色底物法、量平行线法。其中，显色底物法、量平行线法检测时间过长，生产过程样品较多，并且检测结果不能与临床检测方法进行对比。凝固法检测注射用人凝血因子ⅷ生物制品效价的原理是利用全自动凝血仪检测样品的凝固时间，通过标准曲线将凝固时间换算为人凝血因子ⅷ效价。中国药典2020年版收录了针对人血浆基质的人凝血因子ⅷ效价检测方法，但是，其基质与重组人凝血因子ⅷ(rfⅷ)有较大差异，无法准确检测制品中fviii因子效价。
技术实现思路
2、本专利技术提供了一种检测注射用重组人凝血因子ⅷ效价的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
3、(1)将注射用重组人凝血因子ⅷ标准品配置成不同浓度的标准品溶液，在全自动凝血仪上进行检测，记录凝固时间，绘制标准曲线；
4、(2)将待测注射用重组人凝血因子ⅷ样品用稀释液1配置成溶液a，然后加入乏ⅷ因子血浆稀释得到供试品溶液1，加入稀释液1稀释得到供试品溶液2；在全自动凝血仪上进行检测，记录凝固时间，利用标准曲线计算出供试品溶液1和供试品溶液2的效价，分别乘以各自的稀释倍数，取平均值，得到待测注射用重组人凝血因子ⅷ样品的效价；
5、所述稀释液1为包含以下成分的缓冲液：0.4％-0.8％g/ml三羟甲基氨基甲烷，0.70％-1.1％g/ml氯化钠，人血白蛋白0.6％-1.0％g/ml；所述稀释液1的ph值为7.0-8.0。
6、进一步地，所述稀释液1为包含以下成分的缓冲液：0.6％g/ml三羟甲基氨基甲烷，0.88％g/ml氯化钠，人血白蛋白0.8％g/ml。
7、进一步地，所述稀释液1的ph值为7.4。
8、进一步地，步骤(1)中，所述标准品溶液中的溶剂为生理盐水。
9、进一步地，步骤(2)中，所述溶液a中重组人凝血因子ⅷ的浓度为1.5-3.5iu/ml，所述供试品溶液1中重组人凝血因子ⅷ的浓度为0.25-0.75iu/ml，所述供试品溶液2中重组人凝血因子ⅷ的浓度为0.05-0.45iu/ml；
10、优选地，所述溶液a中重组人凝血因子ⅷ的浓度为2.5iu/ml，所述供试品溶液1中重组人凝血因子ⅷ的浓度为0.5iu/ml，所述供试品溶液2中重组人凝血因子ⅷ的浓度为0.25iu/ml。
11、本专利技术还提供了另外一种检测注射用重组人凝血因子ⅷ效价的方法，所述方法包括以下步骤：
12、(i)将注射用重组人凝血因子ⅷ标准品配置成不同浓度的标准品溶液，在全自动凝血仪上进行检测，记录凝固时间，绘制标准曲线；
13、(ii)将待测注射用重组人凝血因子ⅷ样品用稀释液2配置成溶液b，然后加入乏ⅷ因子血浆稀释分别得到供试品溶液1和供试品溶液2；在全自动凝血仪上进行检测，记录凝固时间，利用标准曲线计算出供试品溶液1和供试品溶液2的效价，分别乘以各自的稀释倍数，取平均值，得到待测注射用重组人凝血因子ⅷ样品的效价；
14、所述稀释液2由枸橼酸钠溶液、咪唑缓冲液和人血白蛋白组成，所述枸橼酸钠溶液的浓度为3.5％-4.0％g/ml，所述咪唑缓冲液为包含以下成分的缓冲液：0.15％-0.55％g/ml咪唑、0.40％-0.80％氯化钠，所述咪唑缓冲液的ph值为7.0-8.0；所述枸橼酸钠溶液和咪唑缓冲液的体积比为1：(3-7)；所述稀释液2中，人血白蛋白的浓度为0.5％-1.5％g/ml。
15、进一步地，所述稀释液2由枸橼酸钠溶液、咪唑缓冲液和人血白蛋白组成，所述枸橼酸钠溶液的浓度为3.8％g/ml，所述咪唑缓冲液为包含以下成分的缓冲液：0.34％g/ml咪唑、0.59％氯化钠，所述咪唑缓冲液的ph值为7.3；所述枸橼酸钠溶液和咪唑缓冲液的体积比为1：5；所述稀释液2中，人血白蛋白的浓度为1％g/ml。
16、进一步地，步骤(i)中，所述标准品溶液中的溶剂为乏ⅷ因子血浆。
17、进一步地，步骤(ii)中，所述溶液b中重组人凝血因子ⅷ的浓度为1.5-3.5iu/ml，所述供试品溶液1中重组人凝血因子ⅷ的浓度为0.25-0.75iu/ml，所述供试品溶液2中重组人凝血因子ⅷ的浓度为0.05-0.45iu/ml。
18、进一步地，步骤(ii)中，所述溶液b中重组人凝血因子ⅷ的浓度为2.5iu/ml，所述供试品溶液1中重组人凝血因子ⅷ的浓度为0.5iu/ml，所述供试品溶液2中重组人凝血因子ⅷ的浓度为0.25iu/ml。
19、本专利技术采用凝固法建立了两种检测注射用重组人凝血因子ⅷ效价的方法，本专利技术的两种方法分别在不同检测步骤增加了样品的血浆成分，用于模拟血浆成分的效价检测。本专利技术的检测方法灵敏度高、特异性好、稳定性好，方便快捷，应用前景广阔。
20、显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
21、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。
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1.一种检测注射用重组人凝血因子Ⅷ效价的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述稀释液1为包含以下成分的缓冲液：0.6％g/mL三羟甲基氨基甲烷，0.88％g/mL氯化钠，人血白蛋白0.8％g/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述稀释液1的pH值为7.4。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述标准品溶液中的溶剂为生理盐水。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述溶液a中重组人凝血因子Ⅷ的浓度为1.5-3.5IU/ml，所述供试品溶液1中重组人凝血因子Ⅷ的浓度为0.25-0.75IU/ml，所述供试品溶液2中重组人凝血因子Ⅷ的浓度为0.05-0.45IU/ml；
6.一种检测注射用重组人凝血因子Ⅷ效价的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述稀释液2由枸橼酸钠溶液、咪唑缓冲液和人血白蛋白组成，所述枸橼酸钠溶液的浓度为3.8％g/mL，所述咪唑缓
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(i)中，所述标准品溶液中的溶剂为乏Ⅷ因子血浆。
9.根据权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，步骤(ii)中，所述溶液b中重组人凝血因子Ⅷ的浓度为1.5-3.5IU/ml，所述供试品溶液1中重组人凝血因子Ⅷ的浓度为0.25-0.75IU/ml，所述供试品溶液2中重组人凝血因子Ⅷ的浓度为0.05-0.45IU/ml。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(ii)中，所述溶液b中重组人凝血因子Ⅷ的浓度为2.5IU/ml，所述供试品溶液1中重组人凝血因子Ⅷ的浓度为0.5IU/ml，所述供试品溶液2中重组人凝血因子Ⅷ的浓度为0.25IU/ml。
...【技术特征摘要】
1.一种检测注射用重组人凝血因子ⅷ效价的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述稀释液1为包含以下成分的缓冲液：0.6％g/ml三羟甲基氨基甲烷，0.88％g/ml氯化钠，人血白蛋白0.8％g/ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述稀释液1的ph值为7.4。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述标准品溶液中的溶剂为生理盐水。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述溶液a中重组人凝血因子ⅷ的浓度为1.5-3.5iu/ml，所述供试品溶液1中重组人凝血因子ⅷ的浓度为0.25-0.75iu/ml，所述供试品溶液2中重组人凝血因子ⅷ的浓度为0.05-0.45iu/ml；
6.一种检测注射用重组人凝血因子ⅷ效价的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述稀释液2由枸橼酸钠溶液、咪唑...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢一舟，柳宁，吴佳君，姜晓，陈川，
申请(专利权)人：成都蓉生药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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