【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术基因工程领域，主要涉及一种重组鸽圆环病毒亚单位疫苗（大肠杆菌源）疫苗抗原的制备与应用。具体地，利用基因重组技术，将鸽圆环病毒流行毒株cap蛋白的共有序列与通用thelper 表位串联，并克隆入载体，转化宿主菌，经过发酵、灭活、纯化、乳化工艺制备，得到一种鸽圆环病毒亚单位疫苗（大肠杆菌源）以及该疫苗在预防鸽圆环病毒病中的应用。
技术介绍
1、鸽圆环病毒（pigeon circovirus，picv）是一种主要影响青年鸽的传染性病原，可引起免疫抑制，使病鸽易继发感染其他疾病甚至死亡，严重影响赛鸽的竞翔能力，给养鸽行业造成了巨大的经济损失。picv属于圆环病毒科的圆环病毒属，是已知最小的致病性病毒，呈二十面体对称球形，无囊膜，直径为 17～22 nm，基因组由大约1.7～2.3 kb的单链环状dna组成。picv于1993年在美国发现，随后报道于澳大利亚和欧洲的一些国家，加拿大、英国、德国、比利时、意大利、法国等。近年来日本等国家也有picv感染的报道。2009年，余旭平等报道了浙江地区的鸽圆环病毒感染病例，2011年，万春和等报道了福建地区的鸽圆环病毒病例，2015年，张志成等报道了中国东部６个省份的鸽圆环病毒流行情况。虽然，病例报道不断增多，但是对该病毒感染的发病机制知之甚少。据报道，picv对雏鸽的免疫产生复杂影响，引起雏鸽疾病综合征（ypds）。2017年，中国台湾学者对淘汰赛鸽中164羽死亡鸽子进行picv检测，有96. 95%（159/164）呈picv阳性。同年，有学者对收集于安徽、广东、上海及江苏
2、圆环病毒侵染生长快速的淋巴细胞等宿主细胞，往往导致机体免疫混乱、免疫力下降，进而引起多种条件性病原的继发感染。在鸽圆环病毒阳性群，通常可见 2～12月龄青年鸽患病，但病死率差异很大，推测受多种因素的影响，包括病毒毒力、感染年龄和继发感染等，继发感染通常是造成死亡的直接原因。病鸽通常表现为嗜眠、厌食、生长发育不良、呼吸窘迫、水样腹泻、飞行能力下降等。组织学表现为淋巴器官(法氏囊和胸腺)萎缩，骨髓再生不良，并可观察到呈球状或粗糙颗粒的嗜碱性包涵体。在一些病例中出现整个囊结构的破坏，其它的病理学变化包括轻度的气囊浑浊，肺、肝、心肌散在的炎性细胞浸润等。由于并发细菌、真菌或病毒感染而出现不同的临床症状。picv 既可通过污染的粪便、饲料及饮水等方式水平传播，又可经鸽胚胎垂直传播。目前尚无安全有效的疫苗预防鸽圆环病毒病。
技术实现思路
1、本专利技术以鸽圆环病毒流行毒株cap蛋白的共有序列与通用thelper 表位串联融合蛋白作为疫苗框架结构，同时引入6his标签，在大肠杆菌中表达后，经过灭活、蛋白纯化、乳化等工艺，获得具有理想免疫原性的鸽圆环病毒亚单位疫苗（大肠杆菌源）。本疫苗免疫靶动物后可诱导有效的体液免疫和细胞免疫反应。
2、本专利技术的目的之一在于提供了一种新的能用于预防鸽圆环病毒病的亚单位疫苗多肽及其疫苗组合物；本专利技术的目的之二在于提供了所述鸽圆环病毒的构建及获得方法；本专利技术的目的之三在于提供了能够表达所述鸽圆环病毒亚单位疫苗的基因工程菌株；本专利技术的目的之四在于提供了所述亚单位疫苗的制备方法；本专利技术的目的之五在于提供了所述鸽圆环病毒亚单位疫苗（大肠杆菌源）在预防鸽圆环病毒病中的用途。
3、在第一方面，本专利技术提供了一种用于预防的鸽圆环病毒亚单位疫苗（大肠杆菌源）的多肽及其组合物。其含有鸽圆环病毒流行毒株cap蛋白的共有序列与通用thelper 表位。所述的鸽圆环病毒亚单位疫苗（大肠杆菌源）蛋白或多肽或药学上可接受的盐以及表达抗原表位蛋白所需要的载体。载体也可以包括单独编码各抗原表位的序列，串联可以通过遗传工程方法进行。所述疫苗也包括非免疫活性物质，即为各多肽的连接部分，不具有抗原表位的免疫原性，也不具有任何佐剂活性，主要有纯化标签、接头肽、化学修饰部分、n端信号肽和c端多聚腺苷酸等。所述药学上可接受的盐是指无毒性、刺激和变态反应，适用于人或动物组织的盐。非活性物质和药学上可接受的盐为本领域技术人员所熟知。鸽圆环病毒亚单位疫苗（大肠杆菌源）多肽氨基酸序列如下：
4、mrgshhhhhhgmasmtggqqmgrdlyddddkdrwgsmrkkrrqrrrggvkrglklrhvrprvtrmdvgsgakfvaawtlkaaagdipgcrrrrirrrrtrlrrrghrgsgriyyfrlrrkdkitlpndfkfgsgiftfkladvltvglnaptlkvpfedyqiplvkvdmrpigkgfghtvpiydarlktfqqqvdlgddplmdfdgakkwelrkgfkrlirprpqltitdlatanqvaatwfsgrnqwiplqtsgssldptkvvyygmwfpqkvnhyglafsylhpapdpmyyecevtyyvkfrqfawtalnvpptpnvqgmelmhicngdcpqcfadaldpdsavdse
5、在第二方面，本专利技术提供了一种核苷酸分子，其编码本专利技术第一方面所述的鸽圆环病毒亚单位疫苗（大肠杆菌源）多肽。本专利技术中核苷酸可以是rna形式，dna 形式，通过人工合成方式合成多抗原表位串联序列，然后经过基因工程操作连接后克隆入载体，转化入大肠杆菌，筛选、发酵、灭活、纯化后获得鸽圆环病毒亚单位疫苗多肽。在本专利技术中可以对该核酸进行常规的分子生物学操作，如：pcr、限制性内切酶酶切、连接等，核酸设计5’端和3’端均加入酶切位点。优选本专利技术中的核苷酸序列如下：
6、atg cgg ggt tct cat cat cat cat cat cat ggt atg gct agc atg act ggtgga cag caa atg ggt cgg gat ctg tac gac gat gac gat aag gat cga tgg gga tccatg cgc aaa aaa cgc cgc cag cgc cgc cgc ggc ggc gtg aaa cgc ggc ctg aaa ctgcgc cat gtg cgc ccg cgc gtg acc cgc atg gat gtg ggc agc ggc gcg aaa ttt gtggcg gcg tgg acc ctg aaa gcg gcg gcg ggc gat att ccg ggc tgc cgc cgc cgc cgcatt cgc cgc cgc cgc acc cgc ctg cgc cgc cgc ggc cat cgc ggc agc ggc cgc atttat tat ttt cgc ctg cgc cgc aaa gat aaa att acc ctg ccg aac gat ttt aaa tttggc agc ggc att ttt acc ttt aaa本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。
2.一种核酸分子，其编码权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，其基因序列如序列表中SEQ ID No.1。
3.一种载体，其特征在于含有权利要求2所述的核酸分子。
4.一种宿主菌，其特征在于含有权利要求3所述的载体。
5.一种融合蛋白及其制备方法，其特征在于包括以下步骤：
6.纯化：步骤（5）获得的灭活菌液离心稀释后，进行高压匀浆破碎，破碎后离心，弃上清，收集包涵体；洗涤溶解包涵体后离心，弃沉淀，收集上清用亲和层析法纯化，得到融合蛋白纯化液，此蛋白纯化液为鸽圆环病毒亚单位疫苗（大肠杆菌源）半成品原液。
7.一种鸽圆环病毒亚单位疫苗（大肠杆菌源），其特征在于含有权利要求1所述的融合蛋白。
8.一种鸽圆环病毒亚单位疫苗（大肠杆菌源）的制备方法，其特征在于，将权利要求5步骤（6）获得的鸽圆环病毒亚单位疫苗（大肠杆菌源）半成品原液，用灭菌的PBS稀释成含有15μg /mL融合蛋白的疫苗水相；按水佐剂1：水佐剂2：疫苗水相 =
9.权利要求1所述的融合蛋白或权利要求2所述的核酸或权利要求3所述的载体或权利要求4所述的宿主菌在制备鸽圆环病毒亚单位疫苗（大肠杆菌源）中的用途。
10.权利要求6所述的鸽圆环病毒亚单位疫苗（大肠杆菌源）在预防鸽圆环病毒病中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中seq id no.2所示。
2.一种核酸分子，其编码权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，其基因序列如序列表中seq id no.1。
3.一种载体，其特征在于含有权利要求2所述的核酸分子。
4.一种宿主菌，其特征在于含有权利要求3所述的载体。
5.一种融合蛋白及其制备方法，其特征在于包括以下步骤：
6.纯化：步骤（5）获得的灭活菌液离心稀释后，进行高压匀浆破碎，破碎后离心，弃上清，收集包涵体；洗涤溶解包涵体后离心，弃沉淀，收集上清用亲和层析法纯化，得到融合蛋白纯化液，此蛋白纯化液为鸽圆环病毒亚单位疫苗（大肠杆菌源）半成品原液。
7.一种鸽...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐进，石跃，刘静敏，
申请(专利权)人：北京高鸽生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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