【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、成簇规律间隔短回文重复序列(crispr)和crispr相关(cas)基因(统称为crispr-cas或crispr/cas系统)是古菌和细菌中保护特定物种免受外来遗传元件侵害的适应性免疫系统。
2、在本公开中对任何文献的引用或标识均不是承认该文献可作为本公开的现有技术获得。
技术实现思路
1、针对上述背景，本公开提供优于现有技术的某些优点。尽管本文的公开内容不限于特定优点，但在一方面，本公开提供工程化cas13f多肽，其中所述工程化cas13f多肽：
2、(1)与seq id no:3的氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.6％、99.7％或99.8％)且小于100％的序列同一性；
3、(2)包含对应于seq id no:3的氨基酸序列的双突变y666a和y677a的所述双突变；并且
4、(3)与seq id no:3的氨基酸序列相比具有增加的间隔序列特异性切割活性和/或与seq id no:3的氨基酸序列相比具有降低的间隔序列非依赖性旁切活性。
5、在另一方面，本公开提供多核苷酸，所述多核苷酸编码本公开的工程化cas13f多肽。
6、在又另一方面，本公开提供crispr-cas13f系统，所述crispr-cas13f系统包含：
8、b)指导核酸或编码所述指导核酸的多核苷酸(例如，dna或rna)，所述指导核酸包含：
9、i.能够与所述工程化cas13f多肽形成复合物的同向重复(dr)序列；和
10、ii.能够与靶rna杂交，由此将所述复合物引导至所述靶rna的间隔序列。
11、在又另一方面，本公开提供载体，所述载体包含本公开的多核苷酸。
12、在又另一方面，本公开提供递送系统，所述递送系统包含(1)递送媒介物(vehicle)，和(2)本公开的工程化cas13f多肽、本公开的多核苷酸、本公开的crispr-cas13f系统、或本公开的载体。
13、在又另一方面，本公开提供修饰靶rna的方法，所述方法包括使所述靶rna与本公开的crispr-cas13f系统、本公开的载体、或本公开的递送系统接触，由此修饰所述靶rna。
14、在又另一方面，本公开提供在有需要的受试者中治疗疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用本公开的crispr-cas13f系统，其中所述疾病与靶rna关联，其中所述crispr-cas13f系统修饰所述靶rna，并且其中对所述靶rna的修饰治疗所述疾病。
15、上文大体描述了本公开，本公开的各个方面的更详细描述在下文的单独部分中提供。然而，应理解，为了简洁和减少冗余，本公开的某些实施方式仅在一个部分下描述或仅在权利要求或实施例中描述。因此，还应理解，本公开的任何一个实施方式，包括仅在一个方面、部分下或仅在权利要求或实施例中描述的那些实施方式，可以与本公开的任何其他实施方式组合，除非特别否认或组合不当。
16、本公开的一个或多个实施方式的细节在以下说明书中描述。根据以下附图和几个实施方式的详细描述并且还根据所附权利要求，本公开的其他特征和优点将变得明显。
17、定义
18、本公开将对具体实施方式进行描述，但本公开不限于此，而仅受权利要求书的限制。除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。除非另有说明，如下文所述的术语通常以其通常含义进行理解。
19、概述
20、ii类、vii型crispr相关(cas)蛋白(cas13)，作为核酸可编程rna核酸酶(naprnan)，包括cas13a(c2c2)、cas13b(如cas13b1、cas13b2)、cas13c、cas13d、cas13e和cas13f多肽，能够在包含靶向靶rna的指导序列的指导核酸(例如，指导rna)的指导下切割所述靶rna。在一些实施方式中，所述靶rna是真核的。
21、不希望受理论束缚，在一些实施方式中，指导核酸包含负责与cas13形成复合物的支架序列，以及经有意设计为负责与靶rna的靶序列杂交的指导序列，由此将包含cas13和指导核酸的复合物引导至靶rna。
22、参考图7，示例性dsrna被描述为包含5’至3’单个dna链和3’至5’单个dna链。根据常规转录过程，示例性rna转录物可以使用3'至5'单个dna链作为合成模板进行转录，因此3'至5'单个dna链被称为“模板链”或“反义链”。如此转录的rna转录物与5'至3'单个dna链具有相同的一级序列(除了t被u替换外)，因此5'至3'单个dna链被称为“编码链”或“有义链”。
23、示例性指导核酸被描述为包含指导序列和支架序列。指导序列被设计为与rna转录物(靶rna)的一部分杂交，因此指导序列“靶向”所述部分。因此，指导序列设计所基于的靶rna的部分以及指导序列可以与之杂交的部分称为“靶序列”。在一些实施方式中，指导序列与靶序列100％(完全)反向互补。在一些其他实施方式中，指导序列与靶序列反向互补，并且含有与所述靶序列的错配(如图8中例示的)。
24、通常，dsdna的双链序列可以用其5’至3’单个dna链的序列来表示，并且常规地，以5’至3’方向/取向书写。通常，核酸序列(例如，dna序列、rna序列)以5’至3’的方向/取向书写。
25、例如，对于具有5'-atgc-3'的5'至3'单个dna链和3'-tacg-5'的3'至5'单个dna链的dsdna，dsdna可以简单地表示为5'-atgc-3'。正常地，从dsdna转录的rna转录物(靶rna)则具有5'-augc-3'的序列。
26、为了与靶rna杂交，在一个实施方式中，指导核酸的指导序列被设计为具有与靶rna完全反向互补的5’-gcau-3’序列。根据wipo的电子序列表标准st.26，符号“t”用于表示dna中的t和rna中的u两者(参见“表1：核苷酸符号列表”，符号“t”的定义是“dna中的胸腺嘧啶/rna中的尿嘧啶(t/u)”)。因此，在根据st.26的序列表中，这样的指导序列将在gcat中列出，但标记为rna序列。
27、术语
28、如本文所用，如果dna序列，例如5’-atgc-3’被转录成rna序列(例如5'-augc-3')，其中用u(尿苷)替换一级序列中的每个dt(脱氧胸苷，或简称“t”)，并且分别用a(腺苷)、g(鸟苷)和c(胞苷)替换其他da(脱氧腺苷，或简称为“a”)、dg(脱氧鸟苷，或简称为“g”)和dc(脱本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种工程化Cas13f多肽，其中所述工程化Cas13f多肽：
2.如权利要求1所述的工程化Cas13f多肽，所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比具有至少约70％(例如，至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％或150％)的间隔序列特异性切割活性。
3.如权利要求1或2所述的工程化Cas13f多肽，所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比具有最多约120％(例如，最多约120％、115％、110％、105％、100％、95％、90％、85％、80％、75％或70％)的间隔序列非依赖性旁切活性。
4.如权利要求1-3中任一项所述的工程化Cas13f多肽，(1)所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比具有至少约75％的间隔序列特异性切割活性，并且(2)所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比具有最多约90％的间隔序列非依赖性旁切活
5.如权利要求1-3中任一项所述的工程化Cas13f多肽，(1)所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比具有至少约100％的间隔序列特异性切割活性，并且(2)所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比具有最多约90％的间隔序列非依赖性旁切活性。
6.如权利要求1-3中任一项所述的工程化Cas13f多肽，(1)所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比具有至少约130％的间隔序列特异性切割活性，并且(2)所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比具有最多约110％的间隔序列非依赖性旁切活性。
7.如权利要求1-3中任一项所述的工程化Cas13f多肽，(1)所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比具有至少约130％的间隔序列特异性切割活性，并且(2)所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比具有最多约100％的间隔序列非依赖性旁切活性。
8.如权利要求1-3中任一项所述的工程化Cas13f多肽，(1)所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比具有至少约130％的间隔序列特异性切割活性，并且(2)所述工程化Cas13f多肽与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比具有最多约90％的间隔序列非依赖性旁切活性。
9.如权利要求1-8中任一项所述的工程化Cas13f多肽，所述工程化Cas13f多肽包含在对应于选自SEQ ID NO:3的氨基酸序列的以下位置的位置的一个或多个位置处的氨基酸取代：160、161、183、189、200、202、204、205、213、214、222、233、239、240、241、258、259、276、282、283、298、299、300、314、320、329、338、339、345、353、361、383、410、433、451、455、497、508、509、518、520、526、574、595、598、599、601、631、634、638、641、642、647、667、670、762、763及其组合。
10.如权利要求9所述的工程化Cas13f多肽，其中所述氨基酸取代是用非极性氨基酸残基(如甘氨酸(Gly/G)、丙氨酸(Ala/A)、缬氨酸(Val/V)、半胱氨酸(Cys/C)、脯氨酸(Pro/P)、亮氨酸(Leu/L)、异亮氨酸(Ile/I)、蛋氨酸(Met/M)、色氨酸(Trp/W)、苯丙氨酸(Phe/F)，或带正电荷的氨基酸残基(如赖氨酸(Lys/K)、精氨酸(Arg/R)、组氨酸(His/H))进行的取代。
11.如权利要求10所述的工程化Cas13f多肽，其中所述氨基酸取代是用精氨酸(Arg/R)残基取代非精氨酸(Arg/R)残基。
12.如权利要求10所述的工程化Cas13f多肽，其中所述氨基酸取代是用丙氨酸(Ala/A)残基取代非丙氨酸(Ala/A)残基。
13.如权利要求10所述的工程化Cas13f多肽，其中所述氨基酸取代是用缬氨酸(Val/V)残基取代丙氨酸(Ala/A)残基。
14.如权利要求1-13中任一项所述的工程化Cas13f多肽，所述工程化Cas13f多肽包含在对应于选自SEQ ID NO:3的氨基酸序列的以下位置的位置的一个或多个位置处的氨基酸取代：160、161、631、634、638、6...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种工程化cas13f多肽，其中所述工程化cas13f多肽：
2.如权利要求1所述的工程化cas13f多肽，所述工程化cas13f多肽与seq id no:3的氨基酸序列相比具有至少约70％(例如，至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％或150％)的间隔序列特异性切割活性。
3.如权利要求1或2所述的工程化cas13f多肽，所述工程化cas13f多肽与seq id no:3的氨基酸序列相比具有最多约120％(例如，最多约120％、115％、110％、105％、100％、95％、90％、85％、80％、75％或70％)的间隔序列非依赖性旁切活性。
4.如权利要求1-3中任一项所述的工程化cas13f多肽，(1)所述工程化cas13f多肽与seq id no:3的氨基酸序列相比具有至少约75％的间隔序列特异性切割活性，并且(2)所述工程化cas13f多肽与seq id no:3的氨基酸序列相比具有最多约90％的间隔序列非依赖性旁切活性。
5.如权利要求1-3中任一项所述的工程化cas13f多肽，(1)所述工程化cas13f多肽与seq id no:3的氨基酸序列相比具有至少约100％的间隔序列特异性切割活性，并且(2)所述工程化cas13f多肽与seq id no:3的氨基酸序列相比具有最多约90％的间隔序列非依赖性旁切活性。
6.如权利要求1-3中任一项所述的工程化cas13f多肽，(1)所述工程化cas13f多肽与seq id no:3的氨基酸序列相比具有至少约130％的间隔序列特异性切割活性，并且(2)所述工程化cas13f多肽与seq id no:3的氨基酸序列相比具有最多约110％的间隔序列非依赖性旁切活性。
7.如权利要求1-3中任一项所述的工程化cas13f多肽，(1)所述工程化cas13f多肽与seq id no:3的氨基酸序列相比具有至少约130％的间隔序列特异性切割活性，并且(2)所述工程化cas13f多肽与seq id no:3的氨基酸序列相比具有最多约100％的间隔序列非依赖性旁切活性。
8.如权利要求1-3中任一项所述的工程化cas13f多肽，(1)所述工程化cas13f多肽与seq id no:3的氨基酸序列相比具有至少约130％的间隔序列特异性切割活性，并且(2)所述工程化cas13f多肽与seq id no:3的氨基酸序列相比具有最多约90％的间隔序列非依赖性旁切活性。
9.如权利要求1-8中任一项所述的工程化cas13f多肽，所述工程化cas13f多肽包含在对应于选自seq id no:3的氨基酸序列的以下位置的位置的一个或多个位置处的氨基酸取代：160、161、183、189、200、202、204、205、213、214、222、233、239、240、241、258、259、276、282、283、298、299、300、314、320、329、338、339、345、353、361、383、410、433、451、455、497、508、509、518、520、526、574、595、598、599、601、631、634、638、641、642、647、667、670、762、763及其组合。
10.如权利要求9所述的工程化cas13f多肽，其中所述氨基酸取代是用非极性氨基酸残基(如甘氨酸(gly/g)、丙氨酸(ala/a)、缬氨酸(val/v)、半胱氨酸(cys/c)、脯氨酸(pro/p)、亮氨酸(leu/l)、异亮氨酸(ile/i)、蛋氨酸(met/m)、色氨酸(trp/w)、苯丙氨酸(phe/f)，或带正电荷的氨基酸残基(如赖氨酸(lys/k)、精氨酸(arg/r)、组氨酸(his/h))进行的取代。
11.如权利要求10所述的工程化cas13f多肽，其中所述氨基酸取代是用精氨酸(arg/r)残基取代非精氨酸(arg/r)残基。
12.如权利要求10所述的工程化cas13f多肽，其中所述氨基酸取代是用丙氨酸(ala/a)残基取代非丙氨酸(ala/a)残基。
13.如权利要求10所述的工程化cas13f多肽，其中所述氨基酸取代是用缬氨酸(val/v)残基取代丙氨酸(ala/a)残基。
14.如权利要求1-13中任一项所述的工程化cas13f多肽，所述工程化cas13f多肽包含在对应于选自seq id no:3的氨基酸序列的以下位置的位置的一个或多个位置处的氨基酸取代：160、161、631、634、638、641、642、647、667、670、762、763及其组合。
15.如权利要求14所述的工程化cas13f多肽，其中所述氨基酸取代是用丙氨酸(ala/a)残基取代非丙氨酸(ala/a)残基或用缬氨酸(val/v)残基取代丙氨酸(al...
【专利技术属性】
技术研发人员：王兴，
申请(专利权)人：辉大基因治疗新加坡私人有限公司，
类型：发明
国别省市：
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