【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于生产轴干细胞(axsc)的方法以及例如通过此类方法产生的轴干细胞(axsc)及其用途。本专利技术进一步涉及具有一个或多个以下特征的轴干细胞(axsc)：非多能细胞；区域特异性多能干细胞；可从多能干细胞获得；不能分化成胚胎所有组织的细胞类型；仅能够分化成在胚胎发育期间从中心体轴区出现的细胞类型(例如，生骨节、皮肌节和周围神经元)；不能形成畸胎瘤；能够模拟产生轴区(例如，运动神经元、周围神经元、周围神经系统神经元、感觉神经元、骨、软骨、腱、韧带和/或骨骼肌细胞)的前体的特征；不是瞬时细胞；能够分化成运动神经元、周围神经元、肌肉、软骨或骨祖细胞；无限更新的干细胞；能够作为克隆生长。
技术介绍
1、哺乳动物生物体发育的显著标志是胚胎细胞在限定的时间段内自我更新的能力，其维持不同的干细胞库，同时产生分化成各种组织类型的子代。鉴定促进小鼠胚泡中多能滋养层和胚外内胚层细胞的增殖和抑制其分化的机制已导致有见识的细胞培养环境设计，所述细胞培养环境促进无限更新的干细胞系(分别称为esc/psc、tsc和xen)的衍生(martin,1981；evans和kaufman,1981；tanaka等人,1998；niakan等人,2013)。此外，对应于植入前和植入后胚泡的多能系，分别命名为幼稚/基础状态和始发状态，以及最近提出的形成性多能状态(smith,2017)，已经通过操纵调节各自发育阶段的信号传导级联而产生(nichols和smith,2009；brons等人,2007；tesar,2005)。值得注意的是，这些阶段的主要调节
2、涉及广泛增殖和分化的胚泡后发育阶段的一个例子是体轴延伸过程。它从原条(primitive streak)的后部区域开始并且随后从尾芽开始继续，直到轴延伸完成(benazeraf和pourquie,2013)。此过程由干细胞样祖细胞驱动，所述干细胞样祖细胞最初在原条中形成，并且在轴伸长期间，驻留在小鼠胚胎的节-条纹边界(nsb)、尾侧外胚层(cle)和脊索神经铰合区(cnh)中(henrique等人,2015)。这些所谓的轴祖细胞被认为产生所有周围神经元、生骨节和皮肌节谱系，例如运动神经元、周围神经元、周围神经系统神经元、感觉神经元、骨、软骨、腱、韧带和/或骨骼肌细胞(cambray和wilson,2002,2007；garriock等人,2015；attardi等人,2018)和移植实验已经表明它们具有高度的发育可塑性(cambray和wilson,2007；tzouanacou等人,2009；mcgrew等人,2008)。
3、轴祖细胞的特定化(specification)和维持由wnt/β-连环蛋白和fgf信号传导的相互作用驱动(henrique等人,2015)。它们的定义标志是tbxt和sox2的共表达，它们在其他方面通常分别被认为是中胚层和神经发育的非重叠关键调节因子(delfino-machin等人,2005；tsakiridis等人,2014；gouti等人,2014；koch等人,2017)。以上列出的这种表达模式及其解剖位置(其中它们产生周围神经元以及生骨节和皮肌节谱系)导致它们被归类为神经中胚层祖细胞(nmp)(gouti等人,2014，turner等人,2014cambray和wilson,2007；tzouanacou等人,2009；brown和storey,2000；wilson等人,2009；olivera-martinez等人,2012)。脊索祖细胞(wilson和beddington,1996)以及前部和躯干侧板中胚层祖细胞(lpmp)(kinder等人,1999；smith等人,1994；taguchi等人,2014)是存在于轴区中的其他细胞类型。最近的全球转录组学研究显示，虽然所有三种轴祖细胞类型是可以清晰区分的，但它们也共有大量的基因表达模式，使得它们在靶向方法中难以区分(wymeersch等人,2019)。迄今为止，轴祖细胞的功能发育潜力以及它们是否可以转化为干细胞系仍然是开放的问题。
4、已通过wnt和fgf通路的激活从小鼠和人esc衍生出模拟轴nmp的转录表型(包括tbxt和sox2的表达)的祖细胞(gouti等人,2014；turner等人,2014；lippmann等人,2015；tsakiridis和wilson,2015；gouti等人,2017；denham等人,2015；verrier等人,2018)。然而，它们的身份、纯度和分化潜能一直存在争议(edri等人,2018)，并且重要的是，它们的长期自我更新尚未得到证明。
5、已知的用于生产人轴后代的方法是费力的、代价高昂的并且产生被许多其他细胞类型污染的瞬时轴祖细胞。因此，尽管详细了解了哺乳动物中的胚胎轴伸长，但尚未获得轴干细胞(axsc)，并且此阶段在人胚胎中是不可达到的。
技术实现思路
1、本专利技术涉及一种用于生产(或衍生)轴干细胞(axsc)(或神经肌肉骨骼干细胞)的方法，所述方法包括：提供：多能干细胞、胚胎或诱导多能干细胞(例如，人psc和/或esc和/或ipsc，例如，人esc系h9(wa09)或人ipsc系hmgu#1)，优选地在所述衍生/生产之前，将所述多能细胞维持在合适的多能细胞培养基(例如，mtesrtm1，例如，如ludwig t,thomson j.a.,curr protoc stem cell biol.2007年9月所述，或stemmacstmips-brew xf)中，进一步优选地，将所述合适的多能细胞培养基用补充有含或不含维生素a的b27补充物的rpmi 1640培养基替代(例如，如brewer gj,cotman cw.,brain res.1989年8月7日；494(1):65-74所述)用于所述衍生/生产(即，在所述衍生/生产之前)；激活wnt/β-连环蛋白信号传导通路(例如，go:0016055；例如，wnt/β-连环蛋白信号传导通路是一系列分子信号，其通过wnt蛋白与靶细胞表面上的卷曲家族受体的结合启动，并且以细胞状态的改变结束(huelsken j,birchmeier w.,new aspects of wnt signalling pathways in higher本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于生产轴干细胞(AxSC)的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的用于生产轴干细胞的方法，所述方法进一步包括使衍生自步骤(c)和/或步骤(d)的细胞传代。
3.根据前述权利要求中任一项所述的用于生产轴干细胞的方法，所述方法包括步骤(d)；并且进一步包括：步骤(d1)、(d2)或(d3)。
4.根据前述权利要求中任一项所述的用于前述产轴干细胞的方法，其中所述轴干细胞具有一个或多个以下特征：
5.根据前述权利要求中任一项所述的用于前述产轴干细胞的方法，其中所述轴干细胞不是神经中胚层祖细胞(NMp)，其中所述轴干细胞表达一种或多种以下蛋白质：
6.根据前述权利要求中任一项所述的用于前述产轴干细胞的方法，其中所述轴干细胞能够无限更新和分化为：
7.根据前述权利要求中任一项所述的用于前述产轴干细胞的方法，其中所述轴干细胞是人轴干细胞。
8.一种轴干细胞，所述轴干细胞是通过根据前述权利要求中任一项所述的用于生产轴干细胞的方法产生的。
9.一种分离的轴干细胞(AxSC)，其中所述轴
10.根据前述权利要求中任一项所述的轴干细胞，其中所述轴干细胞不是神经中胚层祖细胞(NMp)，其中所述轴干细胞表达一种或多种以下蛋白质：
11.根据前述权利要求中任一项所述的轴干细胞，其中所述轴干细胞能够无限自我更新和分化为：
12.根据前述权利要求中任一项所述的轴干细胞，其中所述轴干细胞是人轴干细胞。
13.根据前述权利要求中任一项所述的用于前述产轴干细胞的方法，其中所述轴干细胞是根据前述权利要求中任一项所述的轴干细胞。
14.一种组合物、制剂或试剂盒，所述组合物、制剂或试剂盒包含根据前述权利要求中任一项所述的轴干细胞。
15.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、制剂或试剂盒，其中所述组合物、制剂或试剂盒是药物和/或诊断组合物、制剂或试剂盒。
16.根据前述权利要求中任一项所述的轴干细胞、组合物、制剂或试剂盒，所述轴干细胞、组合物、制剂或试剂盒用作药剂。
17.根据前述权利要求中任一项所述的轴干细胞、组合物、制剂或试剂盒，所述轴干细胞、组合物、制剂或试剂盒用于以下中的一种或多种：
18.一种用于改善有需要的样品或受试者的病症的方法，其中所述方法是以下中的一种或多种：
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法是体外、离体或体内方法。
20.根据前述权利要求中任一项所述的轴干细胞、组合物、制剂和/或试剂盒用于以下中的一种或多种的用途：
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于生产轴干细胞(axsc)的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的用于生产轴干细胞的方法，所述方法进一步包括使衍生自步骤(c)和/或步骤(d)的细胞传代。
3.根据前述权利要求中任一项所述的用于生产轴干细胞的方法，所述方法包括步骤(d)；并且进一步包括：步骤(d1)、(d2)或(d3)。
4.根据前述权利要求中任一项所述的用于前述产轴干细胞的方法，其中所述轴干细胞具有一个或多个以下特征：
5.根据前述权利要求中任一项所述的用于前述产轴干细胞的方法，其中所述轴干细胞不是神经中胚层祖细胞(nmp)，其中所述轴干细胞表达一种或多种以下蛋白质：
6.根据前述权利要求中任一项所述的用于前述产轴干细胞的方法，其中所述轴干细胞能够无限更新和分化为：
7.根据前述权利要求中任一项所述的用于前述产轴干细胞的方法，其中所述轴干细胞是人轴干细胞。
8.一种轴干细胞，所述轴干细胞是通过根据前述权利要求中任一项所述的用于生产轴干细胞的方法产生的。
9.一种分离的轴干细胞(axsc)，其中所述轴干细胞表达转录因子sox-2，基本上不表达oct4转录因子并且基本上不表达同源盒蛋白nanog，其中所述axsc不是多能的，其中所述axsc进一步具有以下一个或多个特征：
10.根据前述权利要求中任一项所述的轴干细胞，其中所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·德鲁克，D·沙波什尼科夫，A·H·阿里，D·凯勒厄兹德米尔，E·露莎，
申请(专利权)人：亥姆霍兹慕尼黑中心德国健康与环境中心，
类型：发明
国别省市：
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