【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学及生殖生物学，具体涉及一种新型单卵子全转录组测序技术。
技术介绍
1、转录组测序是近年来在基础生物学研究领域普遍应用的一种高通量测序技术，能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息，包括mrna和非编码rna(non-coding rna，ncrna)等。根据在构建全基因组文库时选择的引物种类不同，mrna的转录组测序可分为有聚腺苷酸化尾的rna测序(poly(a)rna-seq)以及总rna测序(total rna-seq)。poly(a)rna-seq在文库构建时采用多t引物(oligo dt引物)，因此选择性测序含poly(a)尾的rna，而total rna-seq采用随机引物(random引物)，可测序大部分的rna；
2、细胞核和细胞质是细胞组成最主要的成分，在细胞的生长分化中起到不同侧重的生理功能。细胞核是生物遗传物质存在的主要场所，调控细胞的转录状态。细胞核中转录出的rna经加工后转运至细胞质储存，并可进一步加尾后翻译为蛋白储存。卵母细胞是哺乳动物胚胎形成的起始，关于卵母细胞的研究对于揭示卵母细胞发育过程中的关键生理学事件以指导临床对不孕不育患者的治疗有重要的意义。先前关于卵母细胞的各种高通量测序技术都将卵母细胞作为整体，无法表征不同亚细胞组分的转录组特征，丢失了大量宝贵信息。然而，由于卵母细胞不能在体外培养增殖，且雌性哺乳动物在一周期内的排卵数量十分有限，因此对于卵母细胞的高通量测序研究一直具有样品起始投入量特别低的技术瓶颈限制，普通细胞中通
3、传统细胞实验中的核质分离多采用梯度离心的方式，根据细胞核和细胞质不同的物理密度来分离和富集这些亚细胞组分；但这种分离方式所需要的细胞量很大，通常需要数百万个细胞，这对于卵母细胞这种既不能体外培养分裂繁殖、也较难获取的珍贵细胞来说是无法实现的，因此，需要设计一种新型单卵子全转录组测序技术解决上述问题。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种新型单卵子全转录组测序技术，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种新型单卵子全转录组测序技术，包括以下步骤：
3、s1、准备设备：准备显微注射设备、吸卵核针、0.2％bsa溶液、口吸管及离心管；
4、s2、核质分离：通过s1中准备的设备对卵母细胞进行核质分离并保存；
5、s3、提取建库：采用poly(a)rna-seq和total rna-seq对提取的总rna进行建库；
6、s4、分析校准：测序文库并进行数据对比分析，对卵母细胞中核质rna含量的比例定量。
7、优选的，所述s2中具体步骤为：将取出的卵母细胞通过口吸管转移至注射滴。装载显微注射仪系统的吸卵针和吸核针；利用吸卵针固定一颗卵母细胞，吸核针配合破膜仪破膜后伸入卵母细胞胞质，操作气压泵小心将细胞核吸出并推出细胞质。对下一颗卵母细胞重复该操作；5颗卵母细胞一组，将核质分离后的细胞核和细胞质分别用口吸管从注射滴转移到0.2％bsa溶液滴清洗4次，收集在dnase/rnase-free的离心管，-80℃保存。
8、优选的，所述s3步骤中在核质分离后收集的样品中添加合适且等量的ercc，室温用trizol法提取总rna，然后采用poly(a)rna-seq和total rna-seq两种建库方式。
9、优选的，所述s3中poly(a)rna-seq建库方式为采用oligodt引物，在总rna中选择性逆转录含poly(a)的rna，构建cdna文库。采用诺唯赞td503试剂盒进行cdna文库的打断、加接头及扩增，经过磁珠筛选后构建合适片段大小的文库进行测序。
10、优选的，所述s3中total rna-seq的建库方法为：首先在室温用trizol法提取总rna，再用abclonal的rrna去除试剂盒去除总rna里的rrna，后使用abclonal的快速建库试剂盒，利用random引物对rna进行逆转录，后加接头及扩增，过磁珠筛选后构建合适片段大小的文库进行测序。
11、优选的，所述s4中将测序后的文库进行比对和数据分析，利用ercc校准，定量卵母细胞中核质rna含量的比例。
12、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
13、1.本专利技术利用显微注射仪，通过显微操作的方式分离卵母细胞的细胞核和细胞质，能利用少量细胞完成核质分离，直观且高效。
14、2.本专利技术核质分离后poly(a)rna-seq和total rna-seq相结合，可以获得更多常规测序所无法得到的转录本亚细胞分布的相关信息。
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1.一种新型单卵子全转录组测序技术，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种新型单卵子全转录组测序技术，其特征在于：所述S2中具体步骤为：将取出的卵母细胞通过口吸管转移至注射滴，装载显微注射仪系统的吸卵针和吸核针；利用吸卵针固定一颗卵母细胞，吸核针配合破膜仪破膜后伸入卵母细胞胞质，操作气压泵小心将细胞核吸出并退出细胞质，对下一颗卵母细胞重复该操作；5颗卵母细胞一组，将核质分离后的细胞核和细胞质分别用口吸管从注射滴转移到0.2％BSA溶液滴清洗4次，收集在Dnase/Rnase-free的离心管，-80℃保存。
3.根据权利要求1所述的一种新型单卵子全转录组测序技术，其特征在于：所述S3步骤中在核质分离后收集的样品中添加合适且等量的ERCC，室温用TRIzol法提取总RNA，然后采用poly(A)RNA-seq和total RNA-seq两种建库方式。
4.根据权利要求1所述的一种新型单卵子全转录组测序技术，其特征在于：所述S3中Poly(A)RNA-seq建库方式为采用oligodT引物，在总RNA中选择性逆转录含poly(A)
5.根据权利要求1所述的一种新型单卵子全转录组测序技术，其特征在于：所述S3中Total RNA-seq的建库方法为：首先在室温用TRIzol法提取总RNA，再用Abclonal的rRNA去除试剂盒去除总RNA里的rRNA，后使用Abclonal的快速建库试剂盒，利用random引物对RNA进行逆转录，后加接头及扩增，过磁珠筛选后构建合适片段大小的文库进行测序。
6.根据权利要求1所述的一种新型单卵子全转录组测序技术，其特征在于：所述S4中将测序后的文库进行比对和数据分析，利用ERCC校准，定量卵母细胞中核质RNA含量的比例。
...【技术特征摘要】
1.一种新型单卵子全转录组测序技术，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种新型单卵子全转录组测序技术，其特征在于：所述s2中具体步骤为：将取出的卵母细胞通过口吸管转移至注射滴，装载显微注射仪系统的吸卵针和吸核针；利用吸卵针固定一颗卵母细胞，吸核针配合破膜仪破膜后伸入卵母细胞胞质，操作气压泵小心将细胞核吸出并退出细胞质，对下一颗卵母细胞重复该操作；5颗卵母细胞一组，将核质分离后的细胞核和细胞质分别用口吸管从注射滴转移到0.2％bsa溶液滴清洗4次，收集在dnase/rnase-free的离心管，-80℃保存。
3.根据权利要求1所述的一种新型单卵子全转录组测序技术，其特征在于：所述s3步骤中在核质分离后收集的样品中添加合适且等量的ercc，室温用trizol法提取总rna，然后采用poly(a)rna-seq和total rna-seq两种建库方式。
4.根据权利要求1所述的一种新型...
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