【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物病原检测，特别涉及马铃薯pvx和pvy病毒检测引物及其在qpcr和ddpcr病毒检测中的应用。
技术介绍
1、马铃薯(solanum tuberosum l.)属于茄科茄属的一年生草本植物，是一种重要的世界性粮食作物。病毒病是马铃薯种植生产过程中的主要病害之一，正严重阻碍着马铃薯产业的蓬勃发展。感染病毒的马铃薯，通过块茎积累，导致块茎品质变劣，产量逐年降低，轻者减产20％-50％，重则达80％以上。准确检测和定量马铃薯病毒是防治马铃薯病毒最为关键的指导环节，因此，在马铃薯种植和培育过程中实现对病毒病的及时、快速检测，对保障马铃薯产业健康至关重要。
2、从酶联免疫吸附法(elisa)到pcr扩增法再到实时荧光定量pcr(qpcr)，病毒检测方法正在不断更新优化。现在常用的马铃薯病毒检测方法为pcr及qpcr技术，其中，qpcr灵敏性在应用于植物病毒检测中可达到普通pcr的100-1000倍，且相较于普通pcr技术，qpcr可对目的基因进行相对定量，还大幅节省了检测的时间成本，但qpcr检测法尤其是同时检测多种病毒的多重qpcr体系应用时的不足也比较明显；首先检测时若目的基因发生突变很容易导致漏检且它对低浓度模板检测结果无法确定；其次，qpcr使用标准曲线进行定量，检测结果取决于标准样品，误差较大，不同实验室或不同仪器检测同样的样品，ct值都会有所差异，检测结果还易受模板质量、pcr抑制剂、实验条件等影响，时有检测结果呈假阳性和假阴性的情况。因此，开发新型的检测技术刻不容缓。
3、近年来，在
4、多重pcr能在同一pcr反应管内同时检出多个类别的目的基因，适宜于成组病原体的检测，具有高效性、系统性、经济简便性等优点。引物设计是多重pcr效果优劣的决定性因素。现有的用于qpcr的检测引物在pvx和pvy病毒检测灵敏度和稳定性等方面存在不足，且检测特异性和抗干扰性不强，易漏检，因此，开发一种适用于ddpcr检测体系的单重或者多重pcr尤其是多重pcr的特异性引物对于实现快速准确检测pvx和pvy显得尤为必要。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种马铃薯病毒检测用引物，并提供了利用该引物或形成的引物组在检测马铃薯病毒中的应用，本专利技术的引物能够基于qpcr或ddpcr技术通过单重或者多重pcr体系检测马铃薯病毒，实现单独或同步高特异性、高准确性、高灵敏度检测马铃薯pvy和pvx病毒，尤其是高效、特异且灵敏地定量检测低浓度病毒。
2、本专利技术具体通过以下技术方案实现：
3、本专利技术第一方面提供了了一种马铃薯病毒检测用引物，所述引物为pvx引物对或pvy引物对，其中，所述pvy引物对的核苷酸序列如seq id no.11-12所示，所述pvx引物对的核苷酸序列如seq id no.27-28所示。
4、本专利技术第二方面提供了一种马铃薯病毒检测用引物组，所述引物组包括如上所述的pvx引物对和pvy引物对。
5、本专利技术第三方面提供了一种马铃薯病毒检测用试剂盒，包括如上所述的引物或引物组。
6、进一步地，所述试剂盒中每条引物的浓度为125nm-500nm，更进一步地为250nm。
7、进一步地，所述试剂盒还包括ddpcr evagreen supermix。
8、本专利技术第四方面提供了如上所述的马铃薯病毒检测用引物、如上所述的马铃薯病毒检测用引物组或如上所述的马铃薯病毒检测用试剂盒在检测pvx和/或pvy病毒中的应用。
9、本专利技术第五方面提供了一种基于ddpcr技术检测马铃薯病毒的方法，包括以下步骤：
10、s1、提取待检样本的总rna，反转录得到cdna；
11、s2、以步骤s1的所述cdna为模板，利用如上所述的引物或引物组，采用ddpcr技术进行扩增，检测扩增反应的荧光信号，根据所述荧光信号判断所述待检样本是否感染pvx和/或pvy病毒。
12、进一步地，步骤s2中，每20μl所述ddpcr反应体系包括：2×ddpcr evagreensupermix 10μl、上游引物0.4μl、下游引物0.4μl、模板1μl和ddh2o补足至20μl，其中，所述上游引物和所述下游引物的浓度为125nm-500nm，所述模板的浓度为0.03-300ng/μl；所述ddpcr扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，55-61℃退火45s，循环32-45次；98℃固化微滴10min；变温速度为1-2℃/s。
13、进一步地，循环39次，变温速率为2℃/s。
14、进一步地，当采用ddpcr单重反应体系时，退火温度为56℃；当采用ddpcr双重反应体系时，退火温度为60.5℃。
15、本专利技术的优点及积极效果为：
16、1、本专利技术提供的pvx引物对或pvy引物对具有良好的包容性和较强的特异性，抗干扰能力强，能够实现单独或同步高特异性、高准确性、高灵敏度检测马铃薯pvy和pvx病毒，对pvy和pvx的检测限分别低至8.04和7.61copies/μl，有效降低漏检风险和减少假阳性结果等的发生，而且不同批次、不同设备上的检测结果重现性良好，可靠性高，适用于pvy和/或pvx病毒感染样本的高精度检测，尤其是高效、特异且灵敏地定量检测低浓度病毒。
17、2、本专利技术提供的引物既适用于单重pcr体系，也适用于多重pcr体系，能够实现单独或同步检测pvy和pvx病毒，应用场景广泛。
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1.一种马铃薯病毒检测用引物，其特征在于，所述引物为PVX引物对或PVY引物对，所述PVY引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.11-12所示，所述PVX引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.27-28所示。
2.一种马铃薯病毒检测用引物组，其特征在于，包括PVX引物对和PVY引物对，所述PVY引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.11-12所示，所述PVX引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.27-28所示。
3.一种马铃薯病毒检测用试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的马铃薯病毒检测用引物或者如权利要求2所述的马铃薯病毒检测用引物组。
4.根据权利要求3所述的马铃薯病毒检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中每条引物的浓度为125nM-500nM。
5.根据权利要求3所述的马铃薯病毒检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括ddPCR EvaGreen Supermix。
6.如权利要求1所述的马铃薯病毒检测用引物、如权利要求2所述的马铃薯病毒检测用引物组或如权利要求3-5任一项所述的马铃薯病毒检测用试剂盒在检
7.一种基于ddPCR技术检测马铃薯病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的基于ddPCR技术检测马铃薯病毒的方法，其特征在于，步骤S2中，每20μL所述ddPCR反应体系包括：2×ddPCR EvaGreen Supermix 10μL、上游引物0.4μL、下游引物0.4μL、模板1μL和ddH2O补足至20μL，其中，所述上游引物和所述下游引物的浓度为125nM-500nM，所述模板的浓度为0.03-300ng/μL；
9.根据权利要求8所述的基于ddPCR技术检测马铃薯病毒的方法，其特征在于，循环39次，变温速率为2℃/s。
10.根据权利要求8所述的基于ddPCR技术检测马铃薯病毒的方法，其特征在于，当采用ddPCR单重反应体系时，退火温度为56℃；当采用ddPCR双重反应体系时，退火温度为60.5℃。
...【技术特征摘要】
1.一种马铃薯病毒检测用引物，其特征在于，所述引物为pvx引物对或pvy引物对，所述pvy引物对的核苷酸序列如seq id no.11-12所示，所述pvx引物对的核苷酸序列如seq idno.27-28所示。
2.一种马铃薯病毒检测用引物组，其特征在于，包括pvx引物对和pvy引物对，所述pvy引物对的核苷酸序列如seq id no.11-12所示，所述pvx引物对的核苷酸序列如seq idno.27-28所示。
3.一种马铃薯病毒检测用试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的马铃薯病毒检测用引物或者如权利要求2所述的马铃薯病毒检测用引物组。
4.根据权利要求3所述的马铃薯病毒检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中每条引物的浓度为125nm-500nm。
5.根据权利要求3所述的马铃薯病毒检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括ddpcr evagreen supermix。
6.如权利要求1所述的马铃薯病毒检测用引物、如权利要求2所...
【专利技术属性】
技术研发人员：聂碧华，罗涛，陈汝豪，宋波涛，李佳娜，许彬燕，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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