【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，特别是涉及敲除甘蓝型油菜bnac05g0101700we基因在提高油菜抗菌核病中的应用。
技术介绍
1、菌核病是我国油菜生产上第一大病害，由坏死性真菌核盘菌引起，危害油菜的茎、叶、花和菜荚，以茎秆受害损失最大。油菜在开花结荚时，常常一株一株发病枯死。受害茎、叶的菌丝，通过油菜枝叶的相互接触而蔓延邻近健株，进行再次侵染。在我国油菜主产区，其造成的产量损失达10％-30％。菌核病常年发生面积5000多万亩，占播种面积50％以上。油菜植株感染核盘菌后严重影响菜籽中油酸、蛋白质等的积累，降低了菜籽油的品质。长江流域冬春季多雨、潮湿、温暖致使油菜菌核病发生严重。目前生产上主要釆用栽培和化学的方法防治菌核病，但其效果十分有限。因此，选育抗病品种无疑成为油菜抗菌核病育种最根本也是最有效的方法。然而，当前栽培的甘蓝型油菜品种缺少相关抗性基因，严重制约着油菜抗菌核病育种进程。
2、植物体具有复杂的细胞内和细胞间的信号传导体系，通过产生局部和系统的防御反应，来抵抗病原物的侵染。水杨酸(salicylic acid,sa)、茉莉酸(jasmonic acid,ja)和乙烯(ethylene,et)等植物激素在植物抵抗病原物侵染过程中起着非常关键的作用(bariand jones,2009；pieterse et al.,2012)。一般来说ja/et信号途径与植物对死体型营养型菌的防卫反应相关，而sa信号途径与植物对活体营养型菌的防卫反应相关(bari andjones,2009)。因此，前期大量研究表明是ja/e
3、酪氨酸降解途径在动物中必不可少，若中断将导致严重的代谢疾病。这条途径首先在动物和细菌中被发现，是一条非常重要的代谢途径。fah是酪氨酸代谢途径的最后一个酶，fah(sscd1)基因的突变导致拟南芥在短日照下产生模拟病斑并激活植物防御。模拟病斑突变体是一类在没有明显的逆境、损伤或病原物侵害时，在叶片上能自发地形成类似病原物侵染后的坏死斑的突变体，这类突变体在植物中广泛存在，如：拟南芥、水稻、玉米、高粱、小麦、大麦和花生中等均有报道。这些突变体往往能激活植物体的系统获得性抗性，通常具有与抗病反应相关的细胞学和生物化学特征，对许多病原物表现出局部和系统抗性，是研究植物抗病机理的理想材料。目前，通过对植物模拟病斑突变体的研究，发现许多模拟病斑突变体与植物抗病信号中的水杨酸(salicylic acid,sa)、茉莉素(jasmonic acid,ja)、乙烯(ethylene,et)等信号分子均有相关，它们不同程度地参与了抗病过程中的不同环节，起着非常重要的作用。前期研究证实sscd1突变体产生模拟病斑的同时积累ja，同时激活控ja/et信号途径的部分病程相关基因pdf1.2，vsp1和sa病程相关基因pr1。尽管sscd1中的模拟病斑的产生伴随着sa诱导基因pr1的上调，但与sa信号转导无关；而ja信号通路的中断显著抑制sscd1模拟病斑的产生，因此ja信号传导受体coi1正向调控sscd1模拟病斑。这些结果说明fah基因突变激活拟南芥抗病信号途径，并且这些信号参与调控突变体模拟病斑的形成。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术提供了敲除甘蓝型油菜bnac05g0101700we基因在提高油菜抗菌核病中的应用，敲除甘蓝型油菜bnac05g0101700we基因后明显提高油菜对盘核菌的抗性，为甘蓝型油菜抗病育种提供宝贵的基因资源和种质资源。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、本专利技术提供了敲除甘蓝型油菜bnac05g0101700we基因在提高油菜抗菌核病中的应用。
4、本专利技术还提供了敲除甘蓝型油菜bnac05g0101700we基因在提高油菜茉莉酸含量中的应用。
5、优选的，敲除甘蓝型油菜bnac05g0101700we基因的油菜在短日照下提高油菜抗菌核病和菜茉莉酸含量。
6、本专利技术还提供了敲除甘蓝型油菜bnac05g0101700we基因在油菜抗菌核病育种中的应用。
7、本专利技术提供了一种获取抗菌核病油菜的方法，包括以下步骤后：
8、1)将crispr/cas9质粒酶切，得到酶切质粒；
9、2)将所述步骤1)得到的酶切质粒分别与sgrna1、sgrna2、sgrna3连接，得到连接产物1、连接产物2和连接产物3；
10、所述sgrna1由引物对1退火得到，所述引物对1的上游引物的核苷酸序列如seq idno.1所示，所述引物对1的下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；
11、所述sgrna2由引物对2退火得到，所述引物对2的上游引物的核苷酸序列如seq idno.3所示，所述引物对1的下游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示；
12、所述sgrna3由引物对3退火得到，所述引物对3的上游引物的核苷酸序列如seq idno.5所示，所述引物对1的下游引物的核苷酸序列如seq id no.6所示；
13、3)将所述步骤2)得到的连接产物1、连接产物2和连接产物3分别转化大肠杆菌，提取质粒，将得到的3个质粒构建多靶标载体，得到zmpl-bnac05fah载体；
14、4)将所述步骤3)得到的zmpl-bnac05fah载体转化农杆菌，得到转化菌；
15、5)将所述步骤4)得到的转化菌浸染油菜的下胚轴，再进行植株再生培养，得到抗菌核病油菜。
16、优选的，所述步骤1)使用bsai/eco31i酶切crispr/cas9质粒。
17、优选的，所述步骤2)退火的程序为：95℃10min，55℃10min，14℃5min。
18、优选的，采用cacl2冻融法将zmpl-bnac05fah载体转化农杆菌中。
19、优选的，所述步骤5)转化菌以菌液形式浸染下胚轴，所述菌液的od600值为0.5～0.6；所述浸染的时间为8～10min。
【技术保护点】
1.敲除甘蓝型油菜BnaC05G0101700WE基因在提高油菜抗菌核病中的应用。
2.敲除甘蓝型油菜BnaC05G0101700WE基因在提高油菜茉莉酸含量中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，敲除甘蓝型油菜BnaC05G0101700WE基因的油菜在短日照下提高油菜抗菌核病和菜茉莉酸含量。
4.敲除甘蓝型油菜BnaC05G0101700WE基因在油菜抗菌核病育种中的应用。
5.一种获取抗菌核病油菜的方法，其特征在于，包括以下步骤后：
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)使用BsaI/Eco31I酶切CRISPR/Cas9质粒。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)退火的程序为：95℃10min，55℃10min，14℃5min。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用CaCl2冻融法将zmpl-BnaC05FAH载体转化农杆菌中。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5)转化菌以菌液形式浸染下胚轴，所述菌
...【技术特征摘要】
1.敲除甘蓝型油菜bnac05g0101700we基因在提高油菜抗菌核病中的应用。
2.敲除甘蓝型油菜bnac05g0101700we基因在提高油菜茉莉酸含量中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，敲除甘蓝型油菜bnac05g0101700we基因的油菜在短日照下提高油菜抗菌核病和菜茉莉酸含量。
4.敲除甘蓝型油菜bnac05g0101700we基因在油菜抗菌核病育种中的应用。
5.一种获取抗菌核病油菜的方法，其特征在于，包括以下步骤后：
6.根据...
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