【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于食品安全检测领域，具体涉及一种用于食品危害物双模检测的固相生物传感器的制备方法及其应用。
技术介绍
1、食品安全已成为人类健康的全球挑战，尤其是在发展中国家。其中化学危害是导致食物中毒和食源性疾病的主要食品安全危害因素，主要包括生食原料所含的天然毒素、农药及兽药在养殖过程中的残余等。我们可能会接触到的食品危害物有水产品中常用的孔雀石绿，氯霉素等抗生素类兽药，以及农产品中常用的杀虫剂，除草剂等农药。
2、食品危害物会随食物链逐渐积累在人体内，造成一系列健康危害，包括对生殖系统、神经系统的损伤，乃至诱导癌症的发生。因此，开发食品中危害物的快速、灵敏的检测方法，对食品安全和人体健康等具有十分重要的意义。
3、目前，食品危害物检测最广泛采用的方法是基于大型仪器分析技术，包括高效液相色谱、气相色谱、高效液相色谱-质谱等。这些仪器可以准确有效地检测危害物的残留，但存在着仪器设备昂贵，耗时、检测成本高、步骤繁琐等难点，难以实现对危害物的快速定量检测。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种用于食品危害物双模检测的固相生物传感器的制备方法及其应用，通过酰胺化反应将上转换纳米颗粒修饰在聚二甲基硅氧烷表面，再通过酰胺化反应将食品危害物的适配体序列结合在传感器表面，最后通过碱基互补配对原则将连接有食品危害物的适配体互补序列的金银纳米材料组装在传感器表面；以解决上述现有技术存在的一系列问题，从而实现对食品中危害物的快速、现场化检测，并且可以通
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案；
3、一种用于食品中危害物双模检测的固相生物传感器的制备方法，具体步骤如下：
4、步骤一，制备核/壳/壳结构的上转换纳米材料；
5、(a)取六水合氯化钇溶解于甲醇a中，之后加入油酸和1-十八稀，混合后进行第一次加热，停止加热后，待溶液冷却至室温，再加入包含氢氧化钠、氟化铵和甲醇b的混合溶液，进行第二次加热，随后升温进行第三次加热，加热后冷却至室温，经离心分离得到沉淀物，再经清洗后得到上转换纳米颗粒种子；将其分散在环己烷中，得到上转换纳米颗粒种子溶液；
6、(b)取六水合氯化铥和六水合氯化镱溶解于甲醇a中，之后加入油酸和1-十八稀，混合后进行第一次加热反应，反应结束冷却至室温，加入步骤(a)制备的上转换纳米颗粒种子溶液，并滴加氢氧化钠、氟化铵和甲醇b的混合溶液，进行第二次加热，随后升温进行第三次加热，加热后冷却至室温，经离心分离得到沉淀物，再经清洗后得到核/壳结构的上转换纳米颗粒；将其分散在环己烷中，得到核/壳结构的上转换纳米颗粒溶液；
7、(c)取六水合氯化钇溶解于甲醇a中，之后加入油酸和1-十八稀，混合后进行第一次加热反应，反应结束冷却后，加入步骤(c)制备的核/壳结构的上转换纳米颗粒溶液，并滴加氢氧化钠、氟化铵和甲醇b的混合溶液，进行第二次加热，随后升温进行第三次加热，加热后冷却至室温，经反应结束后，经离心分离得到沉淀物，再经清洗后得到核/壳/壳结构的上转换纳米颗粒；
8、步骤二，上转换纳米材料表面改性；取步骤一制备得到的核/壳/壳结构的上转换纳米颗粒加入三氯甲烷和甲苯的混合溶液中，随后加入聚丙烯酸和水的混合液并密封，进行搅拌反应，反应结束后经离心清洗，得到具有亲水性的聚丙烯酸修饰的上转换纳米颗粒；
9、步骤三，制备金银纳米材料；将氯金酸加入超纯水中煮沸，再加入柠檬酸钠a溶液，保持沸腾一段时间后得到金纳米颗粒溶液；然后，在金纳米颗粒溶液中滴加入硝酸银以及柠檬酸钠b溶液，继续保持沸腾一段时间，得到金银纳米颗粒溶液；
10、步骤四，制备靶标适配体修饰的金银纳米材料；将5’端修饰巯基的适配体溶液加入步骤三得到的金银纳米颗粒溶液中，于摇床中恒温孵育后，经离心分离保留沉淀，将其加入ste缓冲液中，得到靶标适配体修饰的金银纳米颗粒溶液；
11、步骤五，制备固相生物传感器；
12、裁取聚二甲基硅氧烷薄膜，使用过氧化氢溶液和浓硫酸的混合溶液浸泡处理后，再浸入3-氨丙基三乙氧基硅烷水溶液中进行加热反应，反应后取出聚二甲基硅氧烷薄膜经氮气吹干，得到氨基功能化的聚二甲基硅氧烷薄膜；
13、将步骤二制备的聚丙烯酸修饰的上转换纳米颗粒加入tris-hcl缓冲液中，然后再加入n-羟基琥珀酰亚胺溶液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液进行反应，反应一段时间后得到活化后的上转换纳米颗粒；再将活化后的上转换纳米颗粒分散在tris-hcl缓冲液中，然后浸入氨基功能化的聚二甲基硅氧烷薄膜进行孵育，孵育后取出氨基功能化的聚二甲基硅氧烷薄膜，即制备得到固相生物传感器；
14、步骤六，固相生物传感器表面生物功能化；
15、将步骤五得到的固相生物传感器浸入n-羟基琥珀酰亚胺溶液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液的混合溶液中进行反应，反应结束后取出固相生物传感器使用去离子水清洗后，重新浸入tris-hcl缓冲液中，并加入靶标适配体互补链溶液，于摇床恒温孵育；孵育结束后，加入步骤四中制备的靶标适配体修饰的金银纳米颗粒溶液，于摇床恒温孵育；反应结束后取出传感器，去离子水清洗，氮气吹干，制备得到生物功能化的固相生物传感器；即为用于食品危害物双模检测的固相生物传感器。
16、优选的，步骤一的(a)中，所述六水氯化钇，甲醇a、油酸、1-十八烯、氢氧化钠、氟化铵和甲醇b的用量关系为303.4mg:10ml:10ml:10ml:266.7mg:340mg:10ml；所述第一次加热的温度为160℃，时间为30min；第二次加热的温度为120℃，时间为30min；第三次加热的温度为300℃，时间为60min；上转换纳米颗粒种子溶液的浓度为1-2mg/ml；
17、优选的，步骤一的(b)中，所述六水氯化镱，六水合氯化铥，甲醇a、油酸、1-十八烯、上转换纳米颗粒种子溶液、氢氧化钠、氟化铵和甲醇b的用量关系为151.2mg:2.9mg:10ml:6ml:16ml:2ml:39.9mg:55.5mg:10ml；所述第一次加热的温度为160℃，时间为30min；第二次加热的温度为120℃，时间为30min；第三次加热的温度为300℃，时间为60min；核/壳结构的上转换纳米颗粒溶液的浓度为1-2mg/ml；
18、优选的，步骤一的(c)中，六水氯化钇，甲醇a、油酸、1-十八烯、核/壳结构上转换纳米颗粒溶液、氢氧化钠、氟化铵和甲醇b的用量关系为121.3mg:10ml:3ml:8ml:4ml:39.9mg：5mg:5ml所述第一次加热的温度为160℃，时间为30min；第二次加热的温度为120℃，时间为30min；第三次加热的温度为300℃，时间为40min；
19、步骤(a)-(c)中所述离心分离的条件均为：转速为8000-9000rpm/min，时间为10-15min；清洗均是使用体积比为本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于食品危害物双模检测的固相生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种用于食品危害物双模检测的固相生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤一的(a)中，所述六水氯化钇、甲醇A、油酸、1-十八烯、氢氧化钠、氟化铵和甲醇B的用量关系为303.4mg:10mL:10mL:10mL:266.7mg:340mg:10mL；所述第一次加热的温度为160℃，时间为30min；第二次加热的温度为120℃，时间为30min；第三次加热的温度为300℃，时间为60min；上转换纳米颗粒种子溶液的浓度为1-2mg/mL；
3.根据权利要求1所述的一种用于食品危害物双模检测的固相生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述核/壳/壳结构上转换纳米颗粒、三氯甲烷、甲苯、聚丙烯酸和水的用量关系为50mg:4mL:6mL:300mg:20mL，搅拌反应时间为20-24h；所述离心清洗采用超纯水和乙醇的混合液，其中超纯水和乙醇的体积比为1:1；所述离心分离的条件为：转速为8000-9000rpm/min，时间为10-15min。
5.根据权利要求1所述的一种用于食品危害物双模检测的固相生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤四中，5’端修饰巯基的靶标适配体溶液与金银纳米颗粒溶液的体积比为1:75，其中5’端修饰巯基的靶标适配体溶液的浓度为100μM，孵育的时间为8-12h，温度为25℃，摇床转速为180-200rpm；所述STE缓冲液的pH为7.4，摩尔浓度为10mmol/L；所述离心分离的条件为：转速为11000-12000rpm/min，时间为10-15min；靶标适配体修饰的金银纳米颗粒溶液的浓度为1-2mg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种用于食品危害物双模检测的固相生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤五中，所述过氧化氢和浓硫酸的体积比为1:3，浸泡的时间为60s；所述3-氨丙基三乙氧基硅烷水溶液的体积分数为5％，加热反应温度为60-70℃，反应时间为3h；所述聚丙烯酸修饰的上转换纳米颗粒、Tris-HCl缓冲液、N-羟基琥珀酰亚胺溶液与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液的用量关系为10mg：8mL：1mL：1mL，其中N-羟基琥珀酰亚胺溶液的浓度为0.5mg/mL，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液的浓度为1mg/mL；反应一段时间为2h；所述活化后的上转换纳米颗粒与Tris-Hcl缓冲液的用量关系为1mg：1mL，其中所述Tris-Hcl缓冲液的pH为7.4，浓度为10mmol/L。
7.根据权利要求1所述的一种用于食品危害物双模检测的固相生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤六中，所述N-羟基琥珀酰亚胺溶液与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液的体积比为1:1，其中N-羟基琥珀酰亚胺溶液的浓度为0.5mg/mL，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液的浓度为1mg/mL；反应时间为2h；所述Tris-Hcl缓冲液的pH为7.4，浓度为10mmol/L；所述Tris-Hcl缓冲液、靶标适配体互补链溶液和靶标适配体修饰的金银纳米颗粒的用量关系为2mL：60μL：40μL；靶标适配体互补链溶液的浓度为100.0μM；恒温孵育的温度均为25℃，孵育时间均为12h。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法制备的固相生物传感器用于食品危害物检测的用途，其特征在于，检测步骤如下：
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，步骤(1)中，所述食品危害物标准溶液的浓度范围为0.1-1000ng/mL；所述Tris-HCl缓冲溶液、食品危害物标准溶液的体积比为1：1；步骤(2)中，所述Tris-HCl缓冲溶液、待测液的体积比为1：1；所述实际样本的预处理方法为：
10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，步骤(1)和(2)中，所述测定固相生物传感器的荧光强度信号的步骤均为：测定固相生物传感器在980nm激发光激发下450nm处的荧光强度值，即为所需的荧光强度信号；所述提取固相生物传感器的图像颜色特征值的步骤为：利用智能手机拍摄固相生物传感器在980nm激发光激发下450nm处的荧光图像，提取相应RGB和Lab值，即为所需的颜色特征值。
...【技术特征摘要】
1.一种用于食品危害物双模检测的固相生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种用于食品危害物双模检测的固相生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤一的(a)中，所述六水氯化钇、甲醇a、油酸、1-十八烯、氢氧化钠、氟化铵和甲醇b的用量关系为303.4mg:10ml:10ml:10ml:266.7mg:340mg:10ml；所述第一次加热的温度为160℃，时间为30min；第二次加热的温度为120℃，时间为30min；第三次加热的温度为300℃，时间为60min；上转换纳米颗粒种子溶液的浓度为1-2mg/ml；
3.根据权利要求1所述的一种用于食品危害物双模检测的固相生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述核/壳/壳结构上转换纳米颗粒、三氯甲烷、甲苯、聚丙烯酸和水的用量关系为50mg:4ml:6ml:300mg:20ml，搅拌反应时间为20-24h；所述离心清洗采用超纯水和乙醇的混合液，其中超纯水和乙醇的体积比为1:1；所述离心分离的条件为：转速为8000-9000rpm/min，时间为10-15min。
4.根据权利要求1所述的一种用于食品危害物双模检测的固相生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述氯金酸、超纯水、柠檬酸钠a溶液、硝酸银、柠檬酸钠b溶液的比例为0.5ml:200ml:3ml:34ml:8ml，其中柠檬酸钠a溶液和柠檬酸钠b溶液均为柠檬酸钠溶液，质量分数均为1％；所述保持沸腾一段时间均为30min。
5.根据权利要求1所述的一种用于食品危害物双模检测的固相生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤四中，5’端修饰巯基的靶标适配体溶液与金银纳米颗粒溶液的体积比为1:75，其中5’端修饰巯基的靶标适配体溶液的浓度为100μm，孵育的时间为8-12h，温度为25℃，摇床转速为180-200rpm；所述ste缓冲液的ph为7.4，摩尔浓度为10mmol/l；所述离心分离的条件为：转速为11000-12000rpm/min，时间为10-15min；靶标适配体修饰的金银纳米颗粒溶液的浓度为1-2mg/ml。
6.根据权利要求1所述的一种用于食品危害物双模检测的固相生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤五中，所述过氧化氢和浓硫酸的体积比为1:3，浸泡的时间为...
【专利技术属性】
技术研发人员：欧阳琴，刘双双，张绍琪，朱丽娜，陈全胜，林颢，李欢欢，郭志明，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：
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