【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因检测，具体涉及一种哺乳动物卵母细胞中mrna监管活性的检测方法。
技术介绍
1、哺乳动物正常受精及生殖是维持及延续种群的重要环节。其中卵子质量对于这一过程及其重要；
2、影响雌性哺乳动物卵子质量的原因很多，其主要以卵子不成熟为特征，或者受精后因其卵子质量不佳而进一步影响胚胎发育，而导致无法正常出生。如果能正确的评估卵子质量，则对理解卵子发生以及早期胚胎发育的机制都具有重要意义。卵母细胞向早期胚胎的基因表达模式转换，即“母源－合子过渡”，是早期胚胎发育过程中的第一个关键事件。母源mrna的适时降解是胚胎自身基因组转录激活的一个重要前提。对一些临床患者的卵子以及阻滞的早期胚胎检测发现，其母源mrna发生了明显累积，但其具体的机制仍然不清楚；
3、无义调节的mrna降解(nonsense-mediated mrna decay,nmd)是一个进化保守的rna质量控制机制，且其存在于所有的真核生物中，它主要负责降解含有提前终止密码子的异常mrna，避免有害的、截短的蛋白产物积累而对细胞造成损害。同时对正常的mrna稳态具有一定的维持作用。但是，至今未见在卵子中检测nmd水平的任何报道，也未发现nmd水平异常与卵子质量相关的报道，因此，需要设计一种哺乳动物卵母细胞中mrna监管活性的检测方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种哺乳动物卵母细胞中mrna监管活性的检测方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、为实现上述目的，
3、步骤一、构建含sox10基因cds以及在cds区域插入3号内含子的质粒，并进而构建能产生提前终止密码子的质粒；
4、步骤二、将质粒转染入hela细胞后进行免疫荧光染色，通过gfp的亮度来代表sox10的表达并进一步确认此质粒的效果；
5、步骤三、对质粒进行体外转录并进行gv期卵母细胞的显微注射后进行免疫荧光染色，通过gfp的亮度来代表sox10的表达显示卵母细胞中rna清除的水平。
6、优选的，所述步骤一中构建能够激活nmd的质粒包括在一段cds之间插入内含子，同时在距内含子55nt之前通过点突变形成提前终止密码子。
7、优选的，所述步骤一中构建能够激活nmd的质粒包括用gfp蛋白与目的蛋白形成融合蛋白，可以利用gfp的荧光水平来表示目的蛋白的表达。
8、优选的，所述步骤二中在能够激活nmd的质粒转染hela细胞时包括除了此质粒，同时转染了表达mcherry的质粒，可以用来排除操作过程中的问题。
9、优选的，所述步骤三中对gv期卵母细胞进行显微注射时通过比较注射含有提前终止密码子与正常含cds的卵母细胞的gfp的荧光水平，显示卵母细胞中rna清除的水平。
10、优选的，所述步骤一中构建的质粒为含有人源sox10基因的cds、含有内含子的cds以及产生三种提前终止密码子的含有内含子的cds的质粒。
11、优选的，主要步骤包括：收集待裂解的hela细胞迅速放入1.5ml离心管中，并加入1ml trizol(invitrogen)用枪头吹打混匀，使细胞裂解充分；相应的操作最好在冰上进行，防止mrna降解；在裂解液中加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀，至液体呈现乳白色；室温静置5分钟，在四度冷冻离心机中12000g离心10分钟；离心结束后，液体将分为三相：上层为水相，中间层为蛋白相，底层为氯仿相；其中rna位于上层的水相中；所以用枪头吸取上层无色水相到一个新的已经加入200μl氯仿的新的1.5ml离心管中，剧烈震荡充分混合均匀，室温静置2到3分钟；四度冷冻离心机中12000g离心15分钟；重新用枪头吸取上层无色水相到一个新的1.5ml离心管中，接着加入等体积的异丙醇，温和地颠倒混匀，室温静置10分钟；四度冷冻离心机中12000g离心15到30分钟；小心地用枪头将相应的液体吸走，加入1ml 75％的乙醇，并上下颠倒离心管，使rna重悬；四度冷冻离心机中12000g离心5分钟，弃掉乙醇，重新放回离心机中12000g离心一分钟，将管壁沾有的液体全部离心到管底，用移液枪吸取干净，加入20μl无rnase水，室温条件下放置10到20分钟，至管底白色沉淀变为透明状态后用nanodrop测量rna的浓度。
12、优选的，主要步骤包括：取1μg的rna置于pcr管中，分别加入1μl random 6mers，1μl dntp mixture，加无rnase水至10μl后，在rcr仪中65度加热5分钟；取出管子插冰上，在pcr管中，继续加入4μl 5×prime script ii buffer，0.5μl rnase inhibitor，1μlprimescript ii rtase，加无rnase水至20μl后在rcr仪中反应；其中，pcr反应条件为30度10分钟，42度60分钟，72度15分钟；
13、随后以cdna作为pcr的模板，利用pcr supermix试剂盒配制pcr反应体系并进行pcr反应，扩增出sox10的cds以及两端添加酶切位点的dna片段，以便后续与已有的骨架连接；其中，pcr反应条件为95度3min，(95度30s，60度30s，72度30s)，72度10min，4度；对pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，接着在紫外灯下利用胶回收试剂盒对目的条带进行回收；
14、将此dna片段与本实验室已有的prk5-flag-gfp的质粒骨架同时进行双酶切，利用t4连接酶(thermo)试剂盒对酶切产物连接，对连接产物进行转化，涂板，挑出单克隆，加入lb培养基扩大培养后送测并进行序列比对。
15、优选的，主要过程包括：取100μl上一步菌液于30ml含有1‰amp霉素抗性的lb培养液中，在37℃摇床以220rpm转速培养16小时；室温下4000xg离心10min，收集菌体；弃培养液，往沉淀中加入2.5ml的solution i/rnase a混合液，漩涡振荡使细胞完全重新悬浮；加入2.5ml solution ii，轻柔地上下颠倒混匀8-10次；加入1.25ml预冷的n3 buffer，轻柔地上下颠倒混匀离心管数次，直至形成白色絮状沉淀，可在室温下静置孵育2min，随后4℃,15000xg离心10min去除沉淀杂质后吸取上清至收集管中；加入0.1倍体积的etr solution，上下颠倒混匀10次，然后冰浴静置10min；将上述裂解液于42℃水浴5min；接着室温4000xg离心5min，etr溶液将在试管底部形成蓝色分层；将上清液移至另一新的15ml试管中，加入0.5倍体积无水乙醇，轻轻上下颠倒试管6—7次，室温放置1—2min；把dna midi结合柱套入15ml收集管中，转移上步得到的3.5ml混合液到结合柱，室温下5000xg离心3min，弃滤液；把结合柱套入收集管中，加入3ml hbc buffer，室温本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种哺乳动物卵母细胞中mRNA监管活性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种哺乳动物卵母细胞中mRNA监管活性的检测方法，其特征在于：所述步骤一中构建能够激活NMD的质粒包括在一段CDS之间插入内含子，同时在距内含子55nt之前通过点突变形成提前终止密码子。
3.根据权利要求1所述的一种哺乳动物卵母细胞中mRNA监管活性的检测方法，其特征在于：所述步骤一中构建能够激活NMD的质粒包括用GFP蛋白与目的蛋白形成融合蛋白，可以利用GFP的荧光水平来表示目的蛋白的表达。
4.根据权利要求1所述的一种哺乳动物卵母细胞中mRNA监管活性的检测方法，其特征在于：所述步骤二中在能够激活NMD的质粒转染Hela细胞时包括除了此质粒，同时转染了表达mCherry的质粒，可以用来排除操作过程中的问题。
5.根据权利要求1所述的一种哺乳动物卵母细胞中mRNA监管活性的检测方法，其特征在于：所述步骤三中对GV期卵母细胞进行显微注射时通过比较注射含有提前终止密码子与正常含CDS的卵母细胞的GFP的荧光水平，显示卵母细胞中RN
6.根据权利要求1所述的一种哺乳动物卵母细胞中mRNA监管活性的检测方法，其特征在于：所述步骤一中构建的质粒为含有人源SOX10基因的CDS、含有内含子的CDS以及产生三种提前终止密码子的含有内含子的CDS的质粒。
7.根据权利要求1所述的一种哺乳动物卵母细胞中mRNA监管活性的检测方法，其特征在于，主要步骤包括：收集待裂解的Hela细胞迅速放入1.5mL离心管中，并加入1mL Trizol(Invitrogen)用枪头吹打混匀，使细胞裂解充分；相应的操作最好在冰上进行，防止mRNA降解；在裂解液中加入200μL氯仿，剧烈振荡混匀，至液体呈现乳白色；室温静置5分钟，在四度冷冻离心机中12000g离心10分钟；离心结束后，液体将分为三相：上层为水相，中间层为蛋白相，底层为氯仿相；其中RNA位于上层的水相中；所以用枪头吸取上层无色水相到一个新的已经加入200μL氯仿的新的1.5mL离心管中，剧烈震荡充分混合均匀，室温静置2到3分钟；四度冷冻离心机中12000g离心15分钟；重新用枪头吸取上层无色水相到一个新的1.5mL离心管中，接着加入等体积的异丙醇，温和地颠倒混匀，室温静置10分钟；四度冷冻离心机中12000g离心15到30分钟；小心地用枪头将相应的液体吸走，加入1mL 75％的乙醇，并上下颠倒离心管，使RNA重悬；四度冷冻离心机中12000g离心5分钟，弃掉乙醇，重新放回离心机中12000g离心一分钟，将管壁沾有的液体全部离心到管底，用移液枪吸取干净，加入20μL无RNase水，室温条件下放置10到20分钟，至管底白色沉淀变为透明状态后用Nanodrop测量RNA的浓度。
8.根据权利要求1所述的一种哺乳动物卵母细胞中mRNA监管活性的检测方法，其特征在于，主要步骤包括：取1μg的RNA置于PCR管中，分别加入1μL Random 6mers，1μL dNTPMixture，加无RNase水至10μL后，在RCR仪中65度加热5分钟；取出管子插冰上，在PCR管中，继续加入4μL 5×Prime Script II Buffer，0.5μL RNase Inhibitor，1μL PrimeScriptII RTase，加无RNase水至20μL后在RCR仪中反应；其中，PCR反应条件为30度10分钟，42度60分钟，72度15分钟；
9.根据权利要求1所述的一种哺乳动物卵母细胞中mRNA监管活性的检测方法，其特征在于，主要过程包括：取100μL上一步菌液于30mL含有1‰Amp霉素抗性的LB培养液中，在37℃摇床以220rpm转速培养16小时；室温下4000xg离心10min，收集菌体；弃培养液，往沉淀中加入2.5mL的Solution I/RNase A混合液，漩涡振荡使细胞完全重新悬浮；加入2.5mLSolution II，轻柔地上下颠倒混匀8-10次；加入1.25mL预冷的N3 Buffer，轻柔地上下颠倒混匀离心管数次，直至形成白色絮状沉淀，可在室温下静置孵育2min，随后4℃,15000xg离心10min去除沉淀杂质后吸取上清至收集管中；加入0.1倍体积的ETR Solution，上下颠倒混匀10次，然后冰浴静置10min；将上述裂解液于42℃水浴5min；接着室温4000xg离心5min，ETR溶液将在试管底部形成蓝色分层；将上清液移至另一新的15mL试管中，加入0.5倍体积无水乙醇，轻轻上下颠倒试管6—7次，室温放置1—2min；把DNA Midi结合柱套入15mL收集...
【技术特征摘要】
1.一种哺乳动物卵母细胞中mrna监管活性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种哺乳动物卵母细胞中mrna监管活性的检测方法，其特征在于：所述步骤一中构建能够激活nmd的质粒包括在一段cds之间插入内含子，同时在距内含子55nt之前通过点突变形成提前终止密码子。
3.根据权利要求1所述的一种哺乳动物卵母细胞中mrna监管活性的检测方法，其特征在于：所述步骤一中构建能够激活nmd的质粒包括用gfp蛋白与目的蛋白形成融合蛋白，可以利用gfp的荧光水平来表示目的蛋白的表达。
4.根据权利要求1所述的一种哺乳动物卵母细胞中mrna监管活性的检测方法，其特征在于：所述步骤二中在能够激活nmd的质粒转染hela细胞时包括除了此质粒，同时转染了表达mcherry的质粒，可以用来排除操作过程中的问题。
5.根据权利要求1所述的一种哺乳动物卵母细胞中mrna监管活性的检测方法，其特征在于：所述步骤三中对gv期卵母细胞进行显微注射时通过比较注射含有提前终止密码子与正常含cds的卵母细胞的gfp的荧光水平，显示卵母细胞中rna清除的水平。
6.根据权利要求1所述的一种哺乳动物卵母细胞中mrna监管活性的检测方法，其特征在于：所述步骤一中构建的质粒为含有人源sox10基因的cds、含有内含子的cds以及产生三种提前终止密码子的含有内含子的cds的质粒。
7.根据权利要求1所述的一种哺乳动物卵母细胞中mrna监管活性的检测方法，其特征在于，主要步骤包括：收集待裂解的hela细胞迅速放入1.5ml离心管中，并加入1ml trizol(invitrogen)用枪头吹打混匀，使细胞裂解充分；相应的操作最好在冰上进行，防止mrna降解；在裂解液中加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀，至液体呈现乳白色；室温静置5分钟，在四度冷冻离心机中12000g离心10分钟；离心结束后，液体将分为三相：上层为水相，中间层为蛋白相，底层为氯仿相；其中rna位于上层的水相中；所以用枪头吸取上层无色水相到一个新的已经加入200μl氯仿的新的1.5ml离心管中，剧烈震荡充分混合均匀，室温静置2到3分钟；四度冷冻离心机中12000g离心15分钟；重新用枪头吸取上层无色水相到一个新的1.5ml离心管中，接着加入等体积的异丙醇，温和地颠倒混匀，室温静置10分钟；四度冷冻离心机中12000g离心15到30分钟；小心地用枪头将相应的液体吸走，加入1ml 75％的乙醇，并上下颠倒离心管，使rna重悬；四度冷冻离心机中12000g离心5分钟，弃掉乙醇，重新放回离心机中12000g离心一分钟，将管壁沾有的液体全部离心到管底，用移液枪吸取干净，加入20μl无rnase水，室温条件下放置10到20分钟，至管底白色沉淀变为透明状态后用nanodrop测量rna的浓度。
8.根据权利要求1所述的一种哺乳动物卵母细胞中mrna监管活性的检测方法，其特征在于，主要步骤包括：取1μg的rna置于pcr管中，分别加入1μl random 6mers，1μl dntpmixture，加无rnase...
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