【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，尤其涉及一种与甘蓝型油菜矮杆基因bna03.iaa7紧密连锁的snp分子标记、kasp标记引物、试剂盒及其应用。
技术介绍
1、油菜是我国重要的油料作物之一，常年播种面积700万公顷以上，年产油量在520万吨，约占国产植物油总产量的47％，是第一大国产食用植物油来源。我国油菜栽培利用历史十分悠久，但产量水平较低，品质较差，通过有效利用国内外优异油菜资源，不断培育高产抗病优质新品种，单产水平由1949年的487.5kg/hm2提高到了2017年的1995.2kg/hm2，品质由“高芥酸和高硫苷”改良为“低芥酸和低硫苷”，营养品质可与橄榄油媲美，营养和利用价值显著提升。在这一系列的油菜育种发展过程中，一方面是优异种质的发掘利用发挥了基础作用；另一方面是分子育种技术的快速发展推进了油菜育种的迅速发展。
2、油菜的育种过程中，性状表型的选择目前主流的方法包括两种，一个是田间表型调查，一种是分子标记的方法。田间表型的调查和鉴定主要依靠育种材料在生长过程中表现出表型后进行调查。此方法取决于对植物在田间的形态特征和生物学特性的视觉识别，判断标准往往很难精确量化，主观性强，检测灵敏度和分辨力低；易受环境和栽培条件影响，准确性和稳定性差；耗时长、时效性差；需投入大量人力、物力，成本高。
3、目前基于snp标记的矮杆基因bna03.iaa7的选择育种方法鲜有报道。而油菜矮杆性状对于育种是非常重要的性状之一。开发基于kasp技术的矮杆基因bna03.iaa7的功能连锁snp标记可以作为一种高效的鉴定标记，支
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是，克服以上
技术介绍
中提到的不足和缺陷，提供一种与甘蓝型油菜矮杆基因bna03.iaa7紧密连锁的snp分子标记、kasp标记引物、试剂盒及其应用，能够快速、高通量、低成本实现矮杆基因bna03.iaa7的基因突变型进行鉴定。
2、为解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案为：
3、一种与甘蓝型油菜矮杆基因bna03.iaa7紧密连锁的snp分子标记的应用，以甘蓝型油菜的darmor-bzh基因组版本为参考，所述snp分子标记在甘蓝型油菜a03染色体上的第18204795位碱基存在多态性，其多态性为g或a。
4、上述的应用，优选的，所述应用为鉴定甘蓝型油菜矮杆/高杆表型；鉴定所述多态性为g时，甘蓝型油菜的表型为矮杆；鉴定所述多态性为a时，甘蓝型油菜的表型高杆。
5、优选的，所述鉴定甘蓝型油菜矮杆/高杆表型采用的kasp标记引物的核苷酸序列由5'端至3'端如下所示：
6、特异性引物x：gtcacattacaaatttttccacacctt(如seq id no:4所示)；
7、特异性引物y：gtcacattacaaatttttccacacctc(如seq id no:5所示)；
8、通用引物c：tgcgtatctagggcaatagtattatgt(如seq id no:6所示)。
9、优选的，所述应用包括以下步骤：
10、(1)提取甘蓝型油菜待测样品的总dna；
11、(2)以步骤(1)提取的dna为模板，分别利用所述的kasp标记引物进行pcr扩增，然后进行荧光信号扫描、基因型分型；如果样品中只检测到特异性引物x的荧光，则该样品的基因型为纯合等位基因x；如果只检测到特异性引物y的荧光，则该样品的基因型为纯合等位基因y；如果同时检测到特异性引物x和y荧光，则该样品的基因型为杂合；
12、(3)根据基因型分型结果进行数据分析，得出甘蓝型油菜待测样品的矮杆基因bna03.iaa7分型。
13、优选的，所述方法采用douglas array tape平台进行；pcr扩增体系包括：100μm通用引物c、100μm特异性引物x、100μm特异性引物y、2×kasp master mix、甘蓝型油菜待测样品的dna、超纯水。
14、优选的，用soellex进行pcr扩增，扩增条件如下：94℃15分钟；94℃20秒，65℃-57℃60秒，10个循环；94℃20秒，57℃60秒，33个循环。
15、基于一个总的专利技术构思，本专利技术还提供一种鉴定甘蓝型油菜矮杆基因bna03.iaa7的kasp标记引物，所述kasp标记引物的核苷酸序列由5'端至3'端如下所示：
16、特异性引物x：gtcacattacaaatttttccacacctt(如seq id no:4所示)；
17、特异性引物y：gtcacattacaaatttttccacacctc(如seq id no:5所示)；
18、通用引物c：tgcgtatctagggcaatagtattatgt(如seq id no:6所示)。
19、基于一个总的专利技术构思，本专利技术还提供一种鉴定甘蓝型油菜矮杆基因bna03.iaa7的试剂盒，包含上述的kasp标记引物。
20、上述的试剂盒，优选的，所述特异性引物x、特异性引物y、通用引物c在pcr反应体系中浓度之比为10～12:10～12:25～30。
21、优选的，所述试剂盒中还包含2×kasp master mix和超纯水。
22、基于一个总的专利技术构思，本专利技术还提供一种所述kasp标记引物或所述试剂盒在鉴定甘蓝型油菜矮杆基因bna03.iaa7中的应用。
23、与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
24、(1)本专利技术筛选出一个与甘蓝型油菜矮杆基因bna03.iaa7紧密连锁的snp分子标记及其kasp标记引物组和试剂盒，用于矮杆基因bna03.iaa7突变型的精准鉴定，这个标记分型质量高、单拷贝、高多态性(在现有甘蓝型油菜资源中的pic值高于>0.3)，样本数据检出率>98％，可用于甘蓝型油菜的矮杆育种改良的标记辅助育种，具有广泛的应用普适性。
25、(2)本专利技术还提供了上述kasp标记引物和试剂盒鉴定甘蓝型油菜矮杆基因bna03.iaa7的应用方法，该检测方法简单、自动化程度高达90％；检测通量高、速度快(8小时可获得122,880个数据点，是传统的96孔板snp基因分型方法的10倍)；检测反试剂用量少(仅0.8ul/反应)，试剂耗材成本低(与传统的96孔板snp基因分型方法相比，试剂耗材成本降低70％-90％)；检测结果准确、重复性和稳定性好，不同检测实验室的数据结果可以相互比较验证，数据具有普适的可比性；本专利技术提供了一种快速、高效、低成本、精准检测的普适性方法。
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1.一种与甘蓝型油菜矮杆基因BnA03.IAA7紧密连锁的SNP分子标记的应用，其特征在于，以甘蓝型油菜的Darmor-bzh基因组版本为参考，所述SNP分子标记在甘蓝型油菜A03染色体上的第18204795位碱基存在多态性，其多态性为G或A。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为鉴定甘蓝型油菜矮杆/高杆表型；鉴定所述多态性为G时，甘蓝型油菜的表型为矮杆；鉴定所述多态性为A时，甘蓝型油菜的表型为高杆。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述鉴定甘蓝型油菜矮杆/高杆表型采用的KASP标记引物的核苷酸序列由5'端至3'端如下所示：
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述方法采用Douglas Array Tape平台进行；PCR扩增体系包括：100μM通用引物C、100μM特异性引物X、100μM特异性引物Y、2×KASPMaster Mix、甘蓝型油菜待测样品的DNA、超纯水。
6.一种鉴定甘蓝型油菜矮杆基因BnA03.IAA
7.一种鉴定甘蓝型油菜矮杆基因BnA03.IAA7的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求6所述的KASP标记引物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物X、特异性引物Y、通用引物C在PCR反应体系中浓度之比为10～12:10～12:25～30。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含2×KASP MasterMix和超纯水。
10.一种如权利要求6所述的KASP标记引物或权利要求7～9中任一项所述的试剂盒在鉴定甘蓝型油菜矮杆基因BnA03.IAA7中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种与甘蓝型油菜矮杆基因bna03.iaa7紧密连锁的snp分子标记的应用，其特征在于，以甘蓝型油菜的darmor-bzh基因组版本为参考，所述snp分子标记在甘蓝型油菜a03染色体上的第18204795位碱基存在多态性，其多态性为g或a。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为鉴定甘蓝型油菜矮杆/高杆表型；鉴定所述多态性为g时，甘蓝型油菜的表型为矮杆；鉴定所述多态性为a时，甘蓝型油菜的表型为高杆。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述鉴定甘蓝型油菜矮杆/高杆表型采用的kasp标记引物的核苷酸序列由5'端至3'端如下所示：
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述方法采用douglas array tape平台进行；pcr扩增体系包括：100μm通用引物c、100μ...
【专利技术属性】
技术研发人员：李乐，贾佩陇，郭铭凯，唐宜，聂超南，唐顺学，
申请(专利权)人：华智生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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