【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及功能酶筛选，具体涉及一种来源于厚壁菌门细菌(firmicutesbacteriumcag:345)的酯水解酶、其编码核酸分子、重组载体、重组细胞、该酯水解酶的制备方法和在制备维生素a棕榈酸酯中的用途，以及一种维生素a棕榈酸酯的制备方法。
技术介绍
1、维生素a棕榈酸酯与维生素a醋酸酯相比，其产品性质更加稳定，可广泛应用于食品、营养强化和医用胶囊等高附加值领域。维生素a棕榈酸酯的合成工艺目前有许多报道，主要包括维生素a醇或维生素a醋酸酯与棕榈酸反应工艺路线，以维生素a醇与棕榈酸反应路线为主。
2、维生素a醇的反应路线基本采用化学法或酶法。化学法是维生素a醋酸酯在助溶剂条件下经碱水解生成，例如中国专利申请201410441389.3公开了维生素a醇的制备工艺，维生素a醋酸酯转化率达99.9％以上。但是水解工艺中使用的koh的摩尔质量是维生素a醋酸酯的1至4倍，同时需要使用大量的水将koh清洗，废水量高。
3、因此，有必要开发可以降低维生素a棕榈酸酯合成中的废水量的酯水解酶。
技术实现思路
1、本专利技术目的在于提供一种来源于厚壁菌门细菌(firmicutesbacterium cag:345)的酯水解酶，旨在解决现有的酯水解酶在催化生产维生素a棕榈酸酯时存在的废水量高的问题。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术从厚壁菌门细菌(firmicutesbacterium cag:345)中获得酯水解酶，并进一步对其进行突变处理，使其在酶
3、具体地，第一方面，本专利技术提供了一种酯水解酶，其为：
4、i)氨基酸序列如seq id no:1所示的蛋白质；或者
5、ii)将seq id no:1所示的氨基酸序列经过一个、两个或更多个氨基酸残基经取代、缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。
6、本专利技术提供的上述酯水解酶中，i)所述蛋白质为母体酯水解酶，ii)所述的蛋白质是i)所述蛋白质的突变体(酯水解酶突变体)，其与母体酯水解酶相比，在催化活力和转化率方面均有显著提升。
7、在一些实施方案中，为了提高酯水解酶突变体的筛选准确性，使用维生素a醋酸酯为反应底物进行通量筛选。
8、在一些实施方案中，ii)所述的蛋白质(酯水解酶突变体)的氨基酸序列如seq idno:2所示。此时，酯水解酶突变体在母体酯水解酶的氨基酸序列基础上，第209位的l突变为v，第334位的f突变为l，第399位的p突变为t、第455位的r突变为g，第536位的d突变为e。
9、本专利技术提供的酯水解酶可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到，例如使用重组技术从原核宿主(如，大肠杆菌)或真核宿主(如酵母、高等植物)中表达获得。
10、在一些实施方案中，所述酯水解酶是通过将含有其编码基因的重组载体转化至大肠杆菌表达宿主(例如e.colibl21(de3))中得到重组工程菌，然后将该重组工程菌进行诱导表达获得。
11、第二方面，本专利技术提供了一种核酸分子，其编码所述酯水解酶。
12、在一些实施方案中，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no:3或seq id no:4所示。
13、本专利技术提供的核酸分子可以通过pcr扩增或人工合成的方法获得。
14、第三方面，一种重组载体，其包含本专利技术所述的核酸分子。
15、在一些实施方案中，所述重组载体为pet-hydrolyase-1或pet-δhydrolyase-mut，分别是将编码所述酯水解酶的核酸分子插入至pet-28a(+)的bamhi和ecori的酶切位点之间，其余序列保持不变得到。
16、第四方面，本专利技术提供了一种重组细胞，其包含本专利技术所述的重组载体。
17、在一些实施方案中，所述重组细胞诱导产生本专利技术提供的来源于厚壁菌门细菌(firmicutesbacteriumcag:345)的酯水解酶。
18、在一些实施方案中，所述重组细胞的构建方法包括：
19、将所述重组载体转化至宿主细胞中，经诱导培养，得到来源于厚壁菌门细菌(firmicutesbacteriumcag:345)的酯水解酶。
20、进一步地，所述重组载体为上述任一所述的重组载体，所述宿主细胞为原核生物生物细胞或真核生物细胞，例如大肠杆菌、酵母等，优选大肠杆菌e.coli bl21(de3)。
21、第五方面，本专利技术提供了一种酯水解酶的制备方法，包括：
22、对本专利技术提供的所述重组细胞进行诱导培养，得到培养物；
23、从所述培养物中分离本专利技术提供的所述酯水解酶。
24、其中，对重组细胞进行诱导培养的方法、从培养物中分离酯水解酶的方法均为本领域的常规方法。
25、在所述诱导培养中所使用的培养基为本领域可以使重组基因工程菌生长并表达的常规培养基，优选lb培养基。
26、在所述诱导培养中，对于培养方法和培养条件没有特殊要求，保证重组基因工程菌株正常生长即可，优选在22℃条件下诱导表达所述酯水解酶。
27、在一些实施方案中，诱导培养所用的诱导剂为iptg。
28、第六方面，本专利技术提供了所述酯水解酶、所述核酸分子、所述突变体、所述重组载体、所述重组细胞和/或所述制备方法制备得到的酯水解酶在制备维生素a棕榈酸酯中的用途。
29、第七方面，本专利技术提供了一种维生素a棕榈酸酯的制备方法，包括：
30、以本专利技术所述酯水解酶、所述重组细胞和/或所述制备方法制备得到的酯水解酶作为催化剂，催化维生素a醋酸酯和水进行酯水解反应，得到维生素a醇溶液；
31、所述维生素a醇溶液与棕榈酸和脂肪酶进行酯化反应，得到维生素a棕榈酸酯。
32、该维生素a棕榈酸酯的制备方法无需使用甲醇或乙醇等醇类溶剂，可以减少后续杂质的产生，提升所得维生素a棕榈酸酯的品质。
33、在一些实施方案中，所述维生素a棕榈酸酯的效价大于180万iu/g，棕榈酸甲酯和棕榈酸乙酯杂质的含量小于8000ppm。优选地，棕榈酸甲酯和棕榈酸乙酯杂质的含量小于5000ppm，更优选地，棕榈酸甲酯和棕榈酸乙酯杂质的含量小于100ppm。
34、在一些实施方案中，所述酯水解反应在助溶剂中进行。
35、在一些优选实施方案中，所述助溶剂选自正己烷、正庚烷和环己烷中的至少一种，从而对酯水解反应生成的维生素a醇有较好的溶解度；更优选正己烷。
36、在一些优选实施方案中，所述助溶剂与所述水的体积比为1:(0.1-0.5)，例如1:0.1、1:0.15、1:0.2、1:0.25、1:0.3、1:0.35、1:0.4、1:0.45或1:0.5，以使反应体系具有较好的混合效果。进一步优选地，所述助溶剂与所述水的体积比为1:(0.15-0.3)。
37、在一些实施方案中，所本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种酯水解酶，其特征在于，所述酯水解酶为：
2.根据权利要求1所述的酯水解酶，其特征在于，ii)所述的蛋白质的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。
3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的酯水解酶；优选地，核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。
4.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求3所述的核酸分子。
5.一种重组细胞，其特征在于，包含权利要求4所述的重组载体。
6.一种酯水解酶的制备方法，其特征在于，包括：
7.权利要求1或2所述的酯水解酶、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的重组载体、权利要求5所述的重组细胞和/或权利要求6所述制备方法制备得到的酯水解酶在制备维生素A棕榈酸酯中的用途。
8.一种维生素A棕榈酸酯的制备方法，其特征在于，包括：
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述酯水解反应在助溶剂中进行；优选地，所述助溶剂选自正己烷、正庚烷和环己烷中的至少一种，更优选正己烷；和/或
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