【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白质分析，具体涉及一种提升酪氨酸磷酸化肽段富集效率的方法及其应用。
技术介绍
1、在真核细胞中，由各种蛋白质激酶的蛋白质磷酸化作用在多种细胞过程中具有重要作用。同时，蛋白质磷酸化几乎只发生在酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基上，而酪氨酸激酶被认为是药物靶标最重要的组分之一。
2、通过基于质谱（ms）进行鉴定磷酸化氨基酸中最重要的步骤是在ms分析前富集磷酸化蛋白或磷酸化肽段。src同源性2(sh2)结构域，具有结合含磷酸化酪氨酸的肽段。通过对sh2结构域进行改造，其对于具有含磷酸化酪氨酸的肽亲和力显著地增强，该被改造的变体sh2结构域被称为超结合体（superbinder）。
3、通过使用琼脂糖与sh2进行偶联，构成sh2-磁珠，其允许从细胞或组织的蛋白酶切多肽中富集含磷酸化酪氨酸的多肽。
4、现有流程中，蛋白酶切产物中含有胰蛋白酶，会对偶联到琼脂糖微球上的sh2蛋白存在一定程度的酶切，导致微球上有效的sh2比例下降，进一步导致酪氨酸磷酸化富集效率低，质谱中存在高强度sh2蛋白的鉴定。
5、尽管目前已有一种新方法，即在样本富集前加入一种蛋白酶抑制苯甲基磺酰氟（pmsf），进行提升磷酸化酪氨酸鉴定数目，但是仍不能解决sh2蛋白的高强度鉴定。因此，开发一种提高酪氨酸磷酸化肽段富集效率的方法实验方法在鉴定磷酸化氨基酸中具有重要应用价值。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种提升酪氨酸磷酸化肽段富集效率
2、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种提升酪氨酸磷酸化肽段富集效率的方法，所述方法包括：
4、（1）采用胰蛋白酶酶切酪氨酸，获得酪氨酸磷酸化肽段；
5、（2）依次对获得的酪氨酸磷酸化肽段进行高温处理和蒸干后复溶；或依次对获得的酪氨酸磷酸化肽段进行蒸干后复溶和高温处理；
6、（3）采用sh2-磁珠富集酪氨酸磷酸化肽段。
7、本专利技术通过采取高温处理和蒸干后复溶或蒸干后复溶和高温处理上述两种处理方式对胰蛋白酶酶切后的肽段进行灭活，再进行酪氨酸磷酸化肽段的富集，与常规的处理方式相比上述灭活方式处理后，酪氨酸磷酸化肽段鉴定数目显著增多，同时能够显著降低sh2蛋白的鉴定强度。
8、优选地，步骤（1）中，所述酶切的反应体系包括胰蛋白酶、酶切溶液和酪氨酸。
9、优选地，所述胰蛋白酶在反应体系的终浓度为0.02-0.1 μg/μl，例如可以是0.02μg/μl、0.04 μg/μl、0.05 μg/μl、0.06 μg/μl、0.08 μg/μl或0.1 μg/μl等。
10、优选地，所述酪氨酸在反应体系的终浓度为1.5-2.5 μg/μl，例如可以是1.5 μg/μl、1.7 μg/μl、1.9 μg/μl、2.0 μg/μl、2.1 μg/μl、2.3 μg/μ或2.5μg/μl等。
11、优选地，所述酶切溶液按浓度计包括：45-55mm 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（hepes）（例如可以是45 mm、47 mm、49 mm、50 mm、51 mm、53 mm或55 mm等），ph=7.5-8.0，例如可以是7.5、7.7、7.9或8.0等。
12、优选地，步骤（1）中，所述酶切的温度为30-37℃，例如可以是30℃、31℃、33℃、35℃或37℃等。
13、优选地，步骤（1）中，所述酶切的时间为12-18 h，例如可以是12 h、14 h、16 h或18h等。
14、优选地，步骤（2）中，所述高温处理的温度为80-100℃，例如可以是80℃、85℃、90℃、95℃或100℃等，优选为90-100℃，进一步优选为90-95℃。
15、优选地，步骤（2）中，所述高温处理的时间为15-30分钟，例如可以是15、20、25或30等，优选为15-25分钟，进一步优选为15-20分钟。
16、本专利技术中，上述高温处理的条件，可在短时间内快速对胰蛋白酶活性进行抑制，同时不引入新的试剂。
17、优选地，步骤（2）中，所述蒸干的条件为40-50℃真空浓缩，例如可以是40℃、45℃或50℃等。
18、优选地，所述真空浓缩的真空度为20±5 hpa例如可以是15 hpa、20 hpa或25 hpa等。
19、本专利技术中，上述蒸干处理的条件，能够保护酪氨酸磷酸化肽段不会降解。
20、优选地，步骤（2）中，所述复溶的溶剂为酶切溶液。
21、作为本专利技术的优选实施方式，所述提升酪氨酸磷酸化肽段富集效率的方法包括：
22、（1）采用胰蛋白酶酶切酪氨酸，所述酶切的反应体系包括胰蛋白酶、酶切溶液和酪氨酸；所述酶切的温度为30-37℃，时间为12-18 h；获得酪氨酸磷酸化肽段；
23、（2）在80-100℃对获得的酪氨酸磷酸化肽段进行高温处理15-30分钟，将高温处理后的酪氨酸磷酸化肽段在40-50℃真空浓缩，真空度为20±5 hpa；蒸干后采用酶切溶液复溶；
24、（3）采用sh2-磁珠富集酪氨酸磷酸化肽段。
25、作为本专利技术的优选实施方式，所述提升酪氨酸磷酸化肽段富集效率的方法包括：
26、（1）采用胰蛋白酶酶切酪氨酸，所述酶切的反应体系包括胰蛋白酶、酶切溶液和酪氨酸；所述酶切的温度为30-37℃，时间为12-18 h；获得酪氨酸磷酸化肽段；
27、（2）将获得的酪氨酸磷酸化肽段在40-50℃真空浓缩，真空度为20 hpa；蒸干后采用酶切溶液复溶；在80-100℃对复溶的酪氨酸磷酸化肽段进行高温处理15-40分钟；
28、（3）采用sh2-磁珠富集酪氨酸磷酸化肽段。
29、第二方面，本专利技术提供一种酪氨酸磷酸化肽段检测和定量的方法，所述方法包括：采用第一方面所述的提升酪氨酸磷酸化肽段富集效率的方法进行磷酸化肽段富集，然后采用液质联用检测系统对所述磷酸化肽段进行检测。
30、本专利技术中，还提供了一种基于液质联用检测系统对所述磷酸化肽段进行检测的方法，基于上述富集方法，得到待检测样品中sh2蛋白含量低，对后续的液质联用检测干扰较小。
31、第三方面，本专利技术提供第一方面所述的提升酪氨酸磷酸化肽段富集效率的方法在酪氨酸磷酸化蛋白质组学检测中的应用。
32、本专利技术所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本专利技术不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
33、相对于现有技术，本专利技术具有以下有益效果：
【技术保护点】
1.一种提升酪氨酸磷酸化肽段富集效率的方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的提升酪氨酸磷酸化肽段富集效率的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述酶切的反应体系包括胰蛋白酶、酶切溶液和酪氨酸；
3.根据权利要求2所述的提升酪氨酸磷酸化肽段富集效率的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述酶切的温度为30-37℃；
4.根据权利要求3所述的提升酪氨酸磷酸化肽段富集效率的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述高温处理的温度为80-100℃。
5.根据权利要求4所述的提升酪氨酸磷酸化肽段富集效率的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述高温处理的时间为10-30分钟。
6.根据权利要求5所述的提升酪氨酸磷酸化肽段富集效率的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述蒸干的条件为40-55℃真空浓缩；
7.一种酪氨酸磷酸化肽段检测和定量的方法，其特征在于，所述方法包括：采用权利要求1-6中任一项所述的提升酪氨酸磷酸化肽段富集效率的方法进行磷酸化肽段富集，然后采用液质联用检测系统对所述磷酸化肽段进行检测。
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...【技术特征摘要】
1.一种提升酪氨酸磷酸化肽段富集效率的方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的提升酪氨酸磷酸化肽段富集效率的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述酶切的反应体系包括胰蛋白酶、酶切溶液和酪氨酸；
3.根据权利要求2所述的提升酪氨酸磷酸化肽段富集效率的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述酶切的温度为30-37℃；
4.根据权利要求3所述的提升酪氨酸磷酸化肽段富集效率的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述高温处理的温度为80-100℃。
5.根据权利要求4所述的提升酪氨酸磷酸化肽段富集...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘怡，李梦林，侯俊杰，郑乃中，贾伟，刘文涛，
申请(专利权)人：嘉华药锐生物科技昆山有限公司，
类型：发明
国别省市：
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