【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物组织培养，涉及一种荷花快繁体系的构建方法。
技术介绍
1、荷花( nelumbo nucifera gaertn. )为莲科莲属多年生水生花卉, 是中国十大传统名花之一，具有很高的观赏价值、经济价值和独特的文化内涵，深受人们喜爱。
2、荷花大多以无性繁殖材料——膨大的地下茎（莲藕）作为种苗，这种传统的种苗生产方式不易管理、还容易传递病虫害、出现品种混杂、退化等现象（李茂年等，2011），组培快繁可解决大部分传统种苗存在的问题，但目前荷花组培快繁的报道中以茎尖为材料时耗材大并且消毒难，以种胚为材料时又受限于青莲子，诱导愈伤分化成组培苗的方法更是少有成果，这些现状导致现有的方案无法满足荷花科研育种和推广应用等需求。植物组织离体培养是一门十分重要的应用技术，快速繁殖、转基因研究与育种都需要组织培养的帮助（刘玉佳，2020），植物组培具有快速大量繁殖、周期短、繁殖系数高、成本低等特点，建立更加简约方便的组织培养体系是扩大荷花无菌种苗的有效手段。可通过添加植物生长调节剂，特别是生长素和细胞分裂素的组合使用，可以精确地调控外植体的生长发育。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种荷花快繁体系的高效构建方法，为荷花的组培技术提供重要的技术基础。
2、本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：
3、一种荷花快繁体系的构建方法，所述方法包括以下步骤：
4
5、（2）初代无菌苗的培养：取出莲心，先将莲心在无菌水中侵泡，然后接入不含激素的ms空白培养基中培养直至莲心出苗，获得初代无菌苗，初代无菌苗时应选择培养基透明无内生菌生长的初代苗；
6、取出的莲心应经过无菌水侵泡，否则易出现褐化，灭菌后不可立即使用需要水凉后使用。
7、（3）走茎增殖：初代无菌苗接种到走茎增殖培养基上培养，直至获得带芽的无菌苗走茎；
8、（4）走茎茎段诱导不定芽：将步骤（3）得到的无菌苗走茎切割为若干个含有2-3个生长点的走茎茎段，为避免枯枝败叶产生内生菌，尽量将走茎茎段的茎叶清理干净，将走茎茎段接到继代培养基上培养，直至走茎茎段的生长点中诱导出不定芽和叶片，获得小苗；
9、（5）继代培养：从步骤（4）得到的小苗中筛选具有3个以上的生长健壮、无畸形的不定芽的小苗，转移接种至新的继代培养基增殖培养，直至小苗长出根后取出小苗进行组培苗的炼苗驯化，获得组培苗；
10、（6）组培苗的炼苗与移栽：从步骤（5）得到的组培苗中筛选健康强壮的苗进行炼苗，移栽。
11、炼苗过程中会发生部分叶片枯萎死亡的情况，但随着炼苗的进行之后会长出新的叶片；在某一个特殊的实施例中，所述移栽为用10cm×10cm的营养钵盛装荷塘土，将组培苗附着的培养基清洗干净，栽入钵中，放置大棚内生长，常规水肥管理。
12、进一步的，步骤（3）所述走茎增殖培养基配方为ms+ 6-ba 0.5 mg/l + iba 1.5mg/l + naa 0.5 mg/l + ga 1 mg/l +蔗糖50 g/l, 琼脂8 g/l, ph=5.6。
13、进一步的，步骤（4）步骤（5）所述继代培养基配方为ms+ 6-ba 1.5 mg/l + iba1.2 mg/l + naa 0.6 mg/l，蔗糖浓度在40~60 g/l, 琼脂8 g/l,ph=5.6。
14、进一步的，步骤（1）所述灭菌为用75%的酒精、3%次氯酸钠消毒灭菌；优选的，步骤（1）所述灭菌为75%的酒精消毒30s，用无菌水冲洗1次，3%次氯酸钠浸泡8 min，再用无菌水冲洗3次，备用。
15、进一步的，步骤（2）莲心在无菌水中浸泡时间为6-8h；在不含激素的ms空白培养基中培养时间为15-20天。
16、进一步的，步骤（2）培养条件为每天光照时间为14-16小时，光照强度控制在1500-2500lx，温度控制在25-28℃。
17、进一步的，步骤（3）培养条件为每天光照时间为14-16小时，光照强度控制在1500-2500lx，温度控制在25-28℃；优选的，每30天更换新鲜培养基；优选的，步骤（3）培养时间为2个月获得大量带芽的地下走茎。
18、进一步的，步骤（4）培养条件为每天光照时间为14-16小时，光照强度1500-2500lx；优选的，步骤（4）培养时间为1个月，1个月后从走茎茎段的生长点中诱导出大量的不定芽和叶片。
19、进一步的，步骤（5）增殖培养时间为1个月，1个月后小苗长出根后取出小苗进行组培苗的炼苗驯化。
20、进一步的，步骤（6）所述炼苗条件为在23℃，1d内14-16小时光照，光照强度1600~2400 lx的光照条件下先松开培养瓶盖敞开并加入无菌水培养24-36小时，接着在室温和自然光照条件下开盖培养48小时。
21、本专利技术的有益效果：
22、本试验进一步进行了改进，获得了最简约的消毒步骤操作简单，死亡率极低，大大降低了污染率（除内生菌外鲜有污染），褐化率极低，初代组培苗成活率可达100%。
23、本专利技术采用先用成熟莲胚培养出无菌苗，通过消毒方法的改善与莲心的适当处理使荷花成熟种子的使用率大大提高，成活率大幅度增加，让荷花组培材料不再受限于新鲜莲子。
24、通过具体的激素比例试验分析了不同生长素和细胞分裂素的比例与芽类型之间的诱导关系，筛选出诱导不同芽类型的激素比例，为荷花组培试验提供新的思路。
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1.一种荷花快繁体系的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的荷花快繁体系的构建方法，其特征在于，步骤（3）所述走茎增殖培养基配方为MS+ 6-BA 0.5 mg/L+ IBA 1.5 mg/L+ NAA 0.5 mg/L+GA 1 mg/L +蔗糖50g/L, 琼脂8 g/L, pH=5.6。
3.根据权利要求1所述的荷花快繁体系的构建方法，其特征在于，步骤（4）步骤（5）所述继代培养基MS+ 6-BA 1.5 mg/L + IBA 1.2 mg/L + NAA 0.6 mg/L，蔗糖浓度在40~60 g/L, 琼脂8 g/L,pH=5.6。
4.根据权利要求1所述的荷花快繁体系的构建方法，其特征在于，步骤（1）所述灭菌为用75%的酒精、3%次氯酸钠消毒灭菌。
5.根据权利要求4所述的荷花快繁体系的构建方法，其特征在于，步骤（1）所述灭菌为用75%的酒精消毒30s，用无菌水冲洗1次，3%次氯酸钠浸泡8 min，再用无菌水冲洗3次，备用。
6.根据权利要求1所述的荷花快繁体系的构建方法，其特
7.根据权利要求1所述的荷花快繁体系的构建方法，其特征在于，步骤（2）培养条件为每天光照时间为14-16小时，光照强度控制在1500-2500Lx，温度控制在25-28℃。
8.根据权利要求1所述的荷花快繁体系的构建方法，其特征在于，步骤（3）培养条件为每天光照时间为14-16小时，光照强度控制在1500-2500Lx，温度控制在25-28℃。
9.根据权利要求8所述的荷花快繁体系的构建方法，其特征在于，步骤（3）培养时间为2个月。
10.根据权利要求1所述的荷花快繁体系的构建方法，其特征在于，步骤（4）培养条件为每天光照时间为14-16小时，光照强度1500-2500 Lx。
11.根据权利要求10所述的荷花快繁体系的构建方法，其特征在于，步骤（4）培养时间为1个月。
12.根据权利要求1所述的荷花快繁体系的构建方法，其特征在于，步骤（5）增殖培养时间为1个月。
13.根据权利要求1所述的荷花快繁体系的构建方法，其特征在于，步骤（6）所述炼苗条件为在23℃，1d内14-16小时光照，光照强度1600~2400 lx的光照条件下先松开培养瓶盖敞开并加入无菌水培养24-36h，接着在室温和自然光照条件下开盖培养48h。
...【技术特征摘要】
1.一种荷花快繁体系的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的荷花快繁体系的构建方法，其特征在于，步骤（3）所述走茎增殖培养基配方为ms+ 6-ba 0.5 mg/l+ iba 1.5 mg/l+ naa 0.5 mg/l+ga 1 mg/l +蔗糖50g/l, 琼脂8 g/l, ph=5.6。
3.根据权利要求1所述的荷花快繁体系的构建方法，其特征在于，步骤（4）步骤（5）所述继代培养基ms+ 6-ba 1.5 mg/l + iba 1.2 mg/l + naa 0.6 mg/l，蔗糖浓度在40~60 g/l, 琼脂8 g/l,ph=5.6。
4.根据权利要求1所述的荷花快繁体系的构建方法，其特征在于，步骤（1）所述灭菌为用75%的酒精、3%次氯酸钠消毒灭菌。
5.根据权利要求4所述的荷花快繁体系的构建方法，其特征在于，步骤（1）所述灭菌为用75%的酒精消毒30s，用无菌水冲洗1次，3%次氯酸钠浸泡8 min，再用无菌水冲洗3次，备用。
6.根据权利要求1所述的荷花快繁体系的构建方法，其特征在于，步骤（2）莲心在无菌水中浸泡时间为6-8h；在不含激素的ms空白培养基中培养时间为15-20天。
<...【专利技术属性】
技术研发人员：徐迎春，邱琳香，金奇江，王彦杰，赵莹，
申请(专利权)人：南京农业大学三亚研究院，
类型：发明
国别省市：
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