【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物转基因，尤其涉及一种农杆菌介导玉米自交系b104幼胚的高效遗传转化方法。
技术介绍
1、玉米作为一种重要的粮饲兼用型作物，在全球作物中占据着极为重要的地位。目前，传统育种方法早已不能满足需要，转基因育种技术对于提高玉米的产量、增强玉米品质和抗逆性等方面具有重要的意义，而发展转基因玉米的研究需要建立高效稳定的遗传转化体系。
2、“农杆菌介导的遗传转化方法”具有操作方法简单、成本低、被转化的dna结构完整且能稳定遗传、转化的外源基因多为单拷贝或低拷贝且很少发生沉默等优点，目前这种方法已广泛应用于包括拟南芥、水稻、玉米、番茄、烟草等多种作物的遗传改良研究。
3、目前，lowe等使用玉米形态调节基因bbm和wus2等刺激并转化细胞，二者结合能够在玉米幼胚表面形成丰富的体细胞胚，扩大可转化的基因型类型，并在一定程度上克服外植体依赖性，缩短转化时间，促进高效转化。后续也有很多研究者通过改造和优化bbm和wus2表达辅助载体，解决转化后玉米植株畸形不育等问题，近一步扩大其应用范围。玉米自交系b104是一种常规用于产生转基因系的温带硬杆自交系，有相关研究表明b104的幼胚和花粉供体植株在大田和温室中的表现较好，可能成为利用农杆菌介导法改良玉米农艺性状的模式自交系。
4、然而，虽然上述公开的研究表明在bbm和wus2等一系列表达辅助载体的应用下可以成功提高玉米转化效率，但“玉米b104骨干自交系”距离商品化和规模化育种还有很大距离，其遗传转化技术在相当多从事玉米研究的实验室中很难开展(转化技术
5、因此，有必要建立一种简单、高效、重复性好的农杆菌介导的玉米自交系b104遗传转化体系。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种简单、高效、重复性好的农杆菌介导玉米自交系b104幼胚的高效遗传转化方法。
2、本专利技术采用以下技术方案解决上述技术问题：
3、一种农杆菌介导玉米自交系b104幼胚的高效遗传转化方法，包括如下步骤：
4、(1)获取玉米幼胚；
5、(2)将含侵染质粒的eha105农杆菌菌株在yep活化培养基上划线，并利用第一悬浮液悬浮活化后的农杆菌，获得od600为0.3的侵染菌液；
6、将步骤(1)获得的玉米幼胚经第二悬浮液洗涤后，加入侵染菌液侵染5min；
7、侵染后，将玉米幼胚连同侵染菌液倒入共培培养基上共培养；
8、(3)将共培养2d后的玉米幼胚置于静息培养基上培养；
9、(4)将静息培养7～10d的胚状体用深蓝激发光源照射，再用体视镜观察，将含有绿色荧光的幼胚，夹掉其胚芽、胚根，转移到含双丙氨膦的筛选分化培养基中进行培养；挑选生长状态好的胚性愈伤组织转移至新的筛选分化培养基进行生长；
10、(5)将上一步筛选出的抗性组织继续置于筛选分化培养基上，分化出幼苗；
11、(6)生根培养及炼苗移栽。
12、作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(1)具体如下：
13、①将授粉9～12d后的玉米果穗，剥去苞叶和花丝后，削去果穗顶部及污染或长虫的部分；用75％酒精喷洒于玉米表面，用19％次氯酸钠、加入1～2滴吐温-20浸泡15min；最后，用无菌水冲洗3～4次，获得干净无菌的玉米果穗；
14、②将提前配置好的第二悬浮液分装到离心管中；
15、③用无菌手术刀片削去玉米果穗子粒的1/3胚乳，再用小刀或镊子从中上部将幼胚挑出，置于第二悬浮液中。
16、作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(2)具体如下：
17、①将含侵染质粒的eha105农杆菌菌株在yep活化培养基上划线，28℃黑暗培养2～3天；利用第一悬浮液悬浮农杆菌菌株，获得侵染菌液；
18、②将浸泡在第二悬浮液不超过1h的玉米幼胚，用第二悬浮液洗涤两次，吸去第二悬浮液；接着再加入1ml新的第二悬浮液，5000rpm常温离心30s，将幼胚沉入离心管下部；45℃水浴热激3min后，置于冰上1min；
19、③吸去玉米幼胚的第二悬浮液，加入1ml od600为0.3的侵染菌液，侵染5min；
20、④侵染后，将玉米幼胚连同侵染菌液倒入共培培养基上，将多余的侵染菌液吸去，用镊子使幼胚盾片的平面向下接触培养基，封口膜封好后于23℃黑暗培养2天。
21、作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(2)中，eha105农杆菌菌株携带的侵染质粒中包含bbm和wus2转录因子。
22、作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(2)中，yep活化培养基配方为：酵母提取物5g/l，nacl 5g/l，蛋白胨10g/l，agar 5g/l，ph7.0。
23、作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(2)中，第一悬浮液配方为：1/2ms，mes0.5g/l，葡萄糖36g/l，蔗糖60g/l，l-脯氨酸0.1g/l，200um as(乙酰丁香酮)，ph5.4；第二悬浮液悬配方为：1/2ms，mes 0.5g/l，葡萄糖36g/l，蔗糖60g/l，l-脯氨酸0.1g/l，ph5.4。
24、作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(2)中，共培培养基配方为：1/2ms，mes0.5g/l，葡萄糖10g/l，蔗糖20g/l，l-脯氨酸0.1g/l，kt 0.1mg/l，2，4-d2mg/l，vb1 0.5mg/l，毒秀定2.2mg/l，agno3 20mm，as(乙酰丁香酮)200mm，cys 200mg/l，植物凝胶3g/l，ph5.8。
25、作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(3)中，静息培养基配方为：ms，蔗糖30g/l，水解酪蛋白0.5g/l，l-脯氨酸1.38g/l，kt 0.1mg/l，2，4-d 2mg/l，vb1 0.5mg/l，毒秀定2.2mg/l，agno3 20mm，特美汀200mg/l，植物凝胶3g/l，ph5.8。
26、作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(4)中，筛选分化培养基配方为：ms，蔗糖60g/l，zt 0.5mg/l，tdz 0.1mg/l，6-ba1mg/l，特美汀200mg/l，双丙胺膦8mg/l，植物凝胶3g/l，ph5.8；
27、同时，所述生长状态好的胚性愈伤组织指“色泽鲜亮、致密颗粒状、干燥松散、生长旺盛的胚性愈伤组织”。
28、作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(6)具体如下：
29、①将分化的幼苗转移入生根培养基中，25℃、5000lx光照培养至生根，10d后生长出根的幼苗；其中，生根培养基配方为：1/2ms，mes 0.5mg/l，蔗糖20g/l，naa0.2mg/l，植物凝胶3g/l，ph5.8；
30、②开盖炼苗；7d后，将长度大于5cm的幼苗进行分子鉴定，记录生成的绿苗数量和阳性苗数量，同时根据检测结果剔除阴性植株，保留阳性植株；...
【技术保护点】
1.一种农杆菌介导玉米自交系B104幼胚的高效遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的农杆菌介导玉米自交系B104幼胚的高效遗传转化方法，其特征在于，所述步骤(1)具体如下：
3.根据权利要求1所述的农杆菌介导玉米自交系B104幼胚的高效遗传转化方法，其特征在于，所述步骤(2)具体如下：
4.根据权利要求1所述的农杆菌介导玉米自交系B104幼胚的高效遗传转化方法，其特征在于，所述步骤(2)中，EHA105农杆菌菌株携带的侵染质粒中包含Bbm和Wus2转录因子。
5.根据权利要求1所述的农杆菌介导玉米自交系B104幼胚的高效遗传转化方法，其特征在于，所述步骤(2)中，YEP活化培养基配方为：酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，蛋白胨10g/L，Agar 5g/L，pH7.0。
6.根据权利要求1所述的农杆菌介导玉米自交系B104幼胚的高效遗传转化方法，其特征在于，所述步骤(2)中，第一悬浮液配方为：1/2MS，MES 0.5g/L，葡萄糖36g/L，蔗糖60g/L，L-脯氨酸0.1g/L，20
7.根据权利要求1所述的农杆菌介导玉米自交系B104幼胚的高效遗传转化方法，其特征在于，所述步骤(2)中，共培培养基配方为：1/2MS，MES 0.5g/L，葡萄糖10g/L，蔗糖20g/L，L-脯氨酸0.1g/L，KT 0.1mg/L，2，4-D 2mg/L，VB10.5mg/L，毒秀定2.2mg/L，AgNO3 20mM，AS200mM，Cys 200mg/L，植物凝胶3g/L，pH5.8。
8.根据权利要求1所述的农杆菌介导玉米自交系B104幼胚的高效遗传转化方法，其特征在于，所述步骤(3)中，静息培养基配方为：MS，蔗糖30g/L，水解酪蛋白0.5g/L，L-脯氨酸1.38g/L，KT 0.1mg/L，2，4-D 2mg/L，VB1 0.5mg/L，毒秀定2.2mg/L，AgNO3 20mM，特美汀200mg/L，植物凝胶3g/L，pH5.8。
9.根据权利要求1所述的农杆菌介导玉米自交系B104幼胚的高效遗传转化方法，其特征在于，所述步骤(4)中，筛选分化培养基配方为：MS，蔗糖60g/L，ZT 0.5mg/L，TDZ 0.1mg/L，6-BA 1mg/L，特美汀200mg/L，双丙胺膦8mg/L，植物凝胶3g/L，pH5.8；
10.根据权利要求1所述的农杆菌介导玉米自交系B104幼胚的高效遗传转化方法，其特征在于，所述步骤(6)具体如下：
...【技术特征摘要】
1.一种农杆菌介导玉米自交系b104幼胚的高效遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的农杆菌介导玉米自交系b104幼胚的高效遗传转化方法，其特征在于，所述步骤(1)具体如下：
3.根据权利要求1所述的农杆菌介导玉米自交系b104幼胚的高效遗传转化方法，其特征在于，所述步骤(2)具体如下：
4.根据权利要求1所述的农杆菌介导玉米自交系b104幼胚的高效遗传转化方法，其特征在于，所述步骤(2)中，eha105农杆菌菌株携带的侵染质粒中包含bbm和wus2转录因子。
5.根据权利要求1所述的农杆菌介导玉米自交系b104幼胚的高效遗传转化方法，其特征在于，所述步骤(2)中，yep活化培养基配方为：酵母提取物5g/l，nacl 5g/l，蛋白胨10g/l，agar 5g/l，ph7.0。
6.根据权利要求1所述的农杆菌介导玉米自交系b104幼胚的高效遗传转化方法，其特征在于，所述步骤(2)中，第一悬浮液配方为：1/2ms，mes 0.5g/l，葡萄糖36g/l，蔗糖60g/l，l-脯氨酸0.1g/l，200um as，ph5.4；第二悬浮液悬配方为：1/2ms，mes 0.5g/l，葡萄糖36g/l，蔗糖60g/l，l-脯氨酸0.1g/l，ph5.4。
7.根据权利要求1所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：王玉，江海洋，张孝凡，王艳萍，徐倩倩，王子萌，柏立洁，司伟娜，李晓玉，程备久，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：
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