【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物检测，具体涉及一种基于srca技术检测桶装水中铜绿假单胞菌的方法。
技术介绍
1、铜绿假单胞菌（ pseudomonas aeruginosa）又称绿脓杆菌，是一种重要的水源性致病菌，广泛存在于各类水体中，对消毒剂、干燥、紫外线等理化因素具有很强的抵抗力，可引起急性肠道炎、脑膜炎、败血症和皮肤炎症等疾病，被世界卫生组织（world healthorganization，who）的危害分析关键控制点（hazard analysis critical control point，hac-cp）评估为婴儿瓶装饮用水的危害指示菌。近年来，随着全球范围内桶装饮用水消费量的不断上升，铜绿假单胞菌在桶装饮用水中的污染屡见报道。
2、目前桶装饮用水中铜绿假单胞菌检测技术，除传统的滤膜法培养外，pcr 和环介导等温扩增技术（lamp）等分子方法也逐步建立起来，应用于水样快速检测中，但是由于成本高、操作难度大、不可视化等原因，以上两种分子方法的推广的力度不大。近两年，可视化跨越式滚环等温扩增（saltatory rolling circle amplification，srca）技术作为食品安全分子生物学检测技术，逐渐在各食品致病菌中进行了探索和运用，如河北农业大学张伟等人利用该技术对沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、克罗诺杆菌等多种致病菌建立了新型的分子检测方法。根据gb 19298-2014《包装饮用水》明确规定，饮用水中不
3、近年来，随着分子检测技术的不断发展，等温扩增技术备受青睐，其中，滚环等温扩增技术因其具有高灵敏度、高特异性、高通量、扩增产物经切胶纯化处理后可直接测序、简单易操作等特点，成为分子检测实用型的一种，为食源性致病菌检测提供新的检测方法。
技术实现思路
1、针对上述问题，本专利技术的目的在于提供一种基于srca技术检测桶装水中铜绿假单胞菌的方法。
2、具体的技术方案如下：
3、一种基于srca技术检测桶装水中铜绿假单胞菌的方法，包括如下步骤：
4、1）多种菌种样品的dna提取；
5、2）srca技术对铜绿假单胞菌的检测方法的建立；
6、3）srca扩增产物测序分析；
7、4）灵敏度验证及可视化反应；
8、5）特异性验证及可视化反应；
9、6）检出限验证及可视化反应；
10、7）检测桶装水中的铜绿假单胞菌。
11、进一步地，步骤1）的具体操作为：收集铜绿假单胞菌、 金黄色葡萄球菌、粪链球菌、枯草芽孢杆菌、白色念球菌、 蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌、荧光假单胞菌、表皮葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌、嗜热链球菌、产气肠杆菌、恶臭假单胞菌、大肠埃希氏菌经营养琼脂培养基培养24h的培养物，提取dna。
12、进一步地，步骤2）的具体操作过程为：
13、a1.以核苷酸序列为seqidno.1的铜绿假单胞菌gbca特异性基因序列为靶基因，设计滚环扩增引物，其中，
14、引物f：5’-gaagccgccaactggaagct-3’，
15、引物r：5’-gttgcagtggtagcactcgc-3’；
16、b1.滚轮扩增，反应体系为20µl，其中10×bst聚合酶buffer 2.0µl、f（10µm）1.0µl、r（10µm）1.0µl、dntp 4.0µl、bst聚合酶（800u）1.0µl、mgso4(25mmol/l) 1.0μl、dna模板：1.0μl，ddh2o：9.0μl，于62℃下反应90min，80℃反应5min；
17、c1.将扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，目标产物在电泳图上呈梯度分布。
18、进一步地，步骤3）的具体操作过程为：选取srca扩增后最小bp大小的三个条带分别进行切胶回收纯化，序列测序，测序结果再与目标序列进行比对。
19、进一步地，步骤4）的具体操作过程为：将铜绿假单胞菌提取好的dna进行浓度测定，再将dna稀释1×100倍、1×102倍、1×103倍、1×104倍、1×105倍、1×106倍、1×107倍以此为模板，各浓度梯度取1µl按照已建立的方法进行滚环扩增，对扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，同时加入稀释10倍的sybr green i 1.0µl，根据电泳条带及颜色反应判断此检测方法对铜绿假单胞菌dna检测的灵敏度。
20、进一步地，步骤5）的具体操作过程为：以步骤1）的样品菌落的dna为模板，取1µl按照步骤2）已建立的方法进行滚环扩增，对扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，同时加入稀释10倍的sybr green i 1.0µl，根据电泳条带及颜色反应判断此检测方法对铜绿假单胞菌检测有无特异性。
21、进一步地，步骤6）的具体操作过程为：将od控制在0.6-0.8的铜绿假单胞菌用0.9%的生理盐水进行梯度稀释，稀释后的菌落数为9.1×108cfu/ml -9.1×100cfu/ml，然后分别取每个梯度的菌落进行dna提取，取1µl按照步骤2）已建立的方法进行滚环扩增，对扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，同时加入稀释10倍的sybr green i 1.0µl，根据电泳条带及颜色反应判断此检测方法对铜绿假单胞菌dna检测的检出限。
22、进一步地，步骤7）的具体操作过程为：在桶装水中添加不同梯度稀释浓度的铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、大肠杆菌，同时设置不添加菌落的对照组，用滚轮扩增的反应体系进行srca反应，同时加入稀释10倍的sybr green i 1.0µl，根据颜色反应判断是否含有铜绿假单胞菌。
23、本专利技术的有益效果在于：
24、1）本专利技术根据铜绿假单胞菌的特异性目标片段，设计了相应的特异性引物，在有目标片段存在的情况下，通过正向引物扩增片段，在bst聚合酶的作用下连接成环，以此为模板，通过反向引物结合在模板上，扩增产物可达57拷贝。该检测方法根据铜绿假单胞菌特异性的目标片段，设计了一对特异性引物，反向引物只有在成环之后才会结合在模板上进行复制，因此，特异性较高；
25、2）本专利技术可以在短时间内对靶序列进行扩增，srca荧光可视法的灵敏度比电泳法高10倍，比常规的pcr法高1000倍；
26、3）本专利技术利用srca技术的优势，针对食源性致病菌-铜绿假单胞菌设计相应的特异本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于SRCA技术检测桶装水中铜绿假单胞菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）的具体操作为：收集铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、粪链球菌、枯草芽孢杆菌、白色念球菌、 蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌、荧光假单胞菌、表皮葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌、嗜热链球菌、产气肠杆菌、恶臭假单胞菌、大肠埃希氏菌经营养琼脂培养基培养24h的培养物，提取DNA。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2）的具体操作过程为：
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）的具体操作过程为：选取SRCA扩增后最小bp大小的三个条带分别进行切胶回收纯化，序列测序，测序结果再与目标序列进行比对。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4）的具体操作过程为：将铜绿假单胞菌提取好的DNA进行浓度测定，再将DNA稀释1×100倍、1×102倍、1×103倍、1×104倍、1×105倍、1×106倍、1×107倍以此为模板，各浓度梯度取1µL按照已建立的方法进行滚环扩增，对扩增产物进
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤5）的具体操作过程为：以步骤1）的样品菌落的DNA为模板，取1µL按照步骤2）已建立的方法进行滚环扩增，对扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，同时加入稀释10倍的SYBR Green I 1.0µL，根据电泳条带及颜色反应判断此检测方法对铜绿假单胞菌检测有无特异性。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤6）的具体操作过程为：将OD控制在0.6-0.8的铜绿假单胞菌用0.9%的生理盐水进行梯度稀释，稀释后的菌落数为9.1×108CFU/mL-9.1×100CFU/mL，然后分别取每个梯度的菌落进行DNA提取，取1µL按照步骤2）已建立的方法进行滚环扩增，对扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，同时加入稀释10倍的SYBR Green I1.0µL，根据电泳条带及颜色反应判断此检测方法对铜绿假单胞菌DNA检测的检出限。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤7）的具体操作过程为：在桶装水中添加不同梯度稀释浓度的铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、大肠杆菌，同时设置不添加菌落的对照组，用滚轮扩增的反应体系进行SRCA反应，同时加入稀释10倍的SYBRGreen I 1.0µL，根据颜色反应判断是否含有铜绿假单胞菌。
...【技术特征摘要】
1.一种基于srca技术检测桶装水中铜绿假单胞菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）的具体操作为：收集铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、粪链球菌、枯草芽孢杆菌、白色念球菌、 蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌、荧光假单胞菌、表皮葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌、嗜热链球菌、产气肠杆菌、恶臭假单胞菌、大肠埃希氏菌经营养琼脂培养基培养24h的培养物，提取dna。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2）的具体操作过程为：
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）的具体操作过程为：选取srca扩增后最小bp大小的三个条带分别进行切胶回收纯化，序列测序，测序结果再与目标序列进行比对。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4）的具体操作过程为：将铜绿假单胞菌提取好的dna进行浓度测定，再将dna稀释1×100倍、1×102倍、1×103倍、1×104倍、1×105倍、1×106倍、1×107倍以此为模板，各浓度梯度取1µl按照已建立的方法进行滚环扩增，对扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，同时加入稀释10倍的sybr green i 1.0µl，根据电泳条带及颜色反应判断此检测方法对铜绿假单胞菌dna...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡彤，朱佳宏，钟卫鸿，郑连宝，沈敏炬，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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