一种靶向pH响应型仿生纳米粒介导的卵巢癌治疗方法技术

技术编号：40326110 阅读：17 留言：0更新日期：2024-02-09 14:20

本发明专利技术公开了一种靶向pH响应型仿生纳米粒介导的卵巢癌治疗方法，包括S1、纳米粒的制备；S2、动态光散射表征；S3、检验AMGNPS的催化性能及化学动力学活性；S4、细胞摄取实验及检测、分析；S5、溶血试验及MRI成像评价；S6、活体对照试验。本方法中通过将亚砷酸钠与锰离子螯合，使纳米粒具有pH响应特性，并通过MRI实现对亚砷酸离子释放的实时监测；利用芬顿样反应产生杀伤肿瘤细胞的羟基自由基，协同饥饿疗法增强CDT；首次使用卵巢癌细胞细胞膜包覆纳米粒，增加卵巢癌细胞对纳米递药系统的摄取，并且实现免疫逃逸和延长血液循环时间，利用pH响应性和同源靶向性放大ATO对卵巢癌的化疗效果。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及卵巢癌治疗，具体为一种靶向ph响应型仿生纳米粒介导的卵巢癌治疗方法。

技术介绍

1、卵巢癌仍是妇科恶性肿瘤患者死亡的主要原因，晚期患者5年生存率低于42％。目前晚期上皮性卵巢癌患者的标准治疗方案是肿瘤细胞减灭术及术后辅助性化疗，化疗常选用紫杉醇联合铂类(顺铂或卡铂)药物。

2、现有技术中，手术和化疗是治疗晚期卵巢癌的常规方法，但其转移、复发和耐药是目前影响治疗效果及预后的主要原因，由于使用游离三氧化二砷治疗需要高剂量，高剂量的药物对脏器功能产生严重的副作用，肿瘤靶向递送系统对三氧化二砷在肿瘤中的药物累积较少，毒副作用较大，削弱了药物的疗效。

3、所以我们提出了一种靶向ph响应型仿生纳米粒介导的卵巢癌治疗方法，以便于解决上述中提出的问题。

技术实现思路

1、本专利技术的目的在于提供一种靶向ph响应型仿生纳米粒介导的卵巢癌治疗方法，以解决上述
技术介绍
提出的使用游离三氧化二砷治疗需要高剂量，高剂量的药物对脏器功能产生严重的副作用，肿瘤靶向递送系统对三氧化二砷在肿瘤中的药物累积较少，毒副作用较大，削弱了药物的疗效的问题。

2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种靶向ph响应型仿生纳米粒介导的卵巢癌治疗方法，包括以下步骤：

3、s1、纳米粒的制备：采用改良的复乳溶剂挥发法制备纳米粒，精密称取适量plga-peg溶于二氯甲烷，加入c0-520，超声混合形成有机相，分成两份，将两份有机相分别处理后，离心得到纳米粒；

4、s2、动态光散射表征：通过动态光散射(dls)对脂质体的流体力学直径和zeta电位进行表征，在透射电子显微镜下观察纳米粒的形态；

5、s3、检验amgnps的催化性能及化学动力学活性：分别对amgnps进行体外酸度实验、过氧化氢浓度检测以及化学动力学活性检测，以检验amgnps的各项性能；

6、s4、细胞摄取实验及检测、分析：以ct26、4t1、n1s1、l929、raw(264.7)和skov3细胞为模型，通过徕卡tcs sp5共聚焦激光扫描显微镜利用clsm方法定性评估细胞摄取，ct26、4t1、n1s1、l929、raw(264.7)和skov3细胞以每孔1×105的密度和特定的细胞培养基接种在24孔培养皿中，对细胞摄取和培养结束后对细胞进行检测和分析；

7、s5、溶血试验及mri成像评价：通过离心法从血清中分离红细胞，洗涤，用pbs稀释辅助进行溶血实验，将含不同浓度(0、0.05、0.1、0.2、0.4和0.5mm)的amgnps@skov3分别分散于不同ph值的缓冲溶液中24h，在1.5t磁共振成像系统上进行mri成像；

8、s6、活体对照试验：通过对小鼠皮下注射skov3细胞使其形成移植瘤，然后分别使用生理盐水、葡萄糖氧化酶、亚砷酸钠、amnps、amgnps、amgnps@skov3静脉注射治疗，一段时间后观察小鼠体重变化及肿瘤体积变化。

9、优选的，在s1中，精密称取适量醋酸锰、亚砷酸钠，分别制成醋酸锰溶液、亚砷酸钠溶液，精密称取适量葡萄糖氧化酶，加入50ul醋酸锰溶液混合后一同加入一份有机相，50ul亚砷酸钠溶液加入另一份有机相，分别使用探头超声2分钟得到乳液，将两份乳液轻轻混合后加入10ml水中探头超声2分钟，随后40℃旋转蒸发20分钟除去二氯甲烷，离心得到纳米粒，采用细胞膜提取试剂盒提取skov3细胞的细胞膜，与适量纳米粒超声混合一段时间后制成amgnps@skov3。

10、优选的，在s2中，取等量离心得到的纳米粒放入透析袋(mw＝3500da)中，在ph值为7.4和5.6的条件下，将含有纳米粒的透析袋浸入10ml pbs溶液中，以模拟正常生理条件及肿瘤组织微环境，然后在37℃下对系统进行磁搅拌，在预先设计的时间点(0.25，0.5，1，1.5，2，3，4，5，6，8，10，12，24，36，48和72h)取1ml释放介质，并再添加1ml新鲜pbs，测量释放介质中药物在不同时间段内的浓度，并对游离as3+和游离mn2+的体外释放进行比较。

11、优选的，在s3中，在进行体外酸度实验时，取5ml的4mg/ml的葡萄糖溶液于小烧杯中，并使用37℃的烘箱预热30min，分别加入50ul的amgnps和amnps后，在磁力搅拌器中均匀搅拌，保持37℃，用ph计检测不同时间点(0，20，40，60，80，100，120，140，160，180min)反应液的ph，准备若干个样品瓶，在每个样品瓶中加入同等浓度和体积的amgnps溶液，然后依次加入不同浓度的葡萄糖溶液，静置孵育4h后，使用ph计测定每个样品瓶中溶液的ph值。

12、优选的，在s3中，在进行过氧化氢浓度检测时，将100ulamgnps和50ul不同浓度葡萄糖依次加入300ul醋酸盐缓冲液(0.01m，ph 4.0)反应30min，随后再加入50ultmb(16mm)，立即将此混合液置于37℃水浴中反应15min，反应结束后用紫外分光光度计测定溶液在652nm处的吸光度值；使用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(tmb)验证羟基自由基的产生，在羟基自由基存在下，tmb在650nm处的吸收增强，将不同ph值的800μl amgnps、mgnps、agnps溶液与20μl30％过氧化氢和100μl tmb(1mg/ml)混合，4h后，使用紫外分光光度计测定400～800nm的吸光度。

13、优选的，在s4中，细胞在37℃和5％co2下培养12小时，在制备纳米粒时用荧光染料罗丹明标记，然后用含有游离罗丹明染料、amgnps、amgnps@skov3的新培养基替换培养基，然后分别培养1或4小时，随后，用pbs洗涤细胞3次，用4％多聚甲醛固定，并用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚(dapi)染色，以便用clsm观察，并用流式细胞术对其进行定量分析。

14、优选的，在s4中，在对细胞的检测和分析还包括以下内容：

15、s41、体外细胞毒性检测：skov3(人卵巢癌细胞)在90％rpmi-1640、15％fbs和1％双抗中培养，通过3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)2，5-二苯基四唑溴化铵(mtt)法进行细胞毒性试验，将skov3细胞以每孔1×104的密度接种在96孔板中，并在37℃和5％co2下培养24小时；然后移除培养基，用不含fbs的培养基将不同的np或试剂稀释至不同浓度，再培养6h、12h、24h，用pbs(ph 7.4)将mtt溶解，将加药培养基吸去后向每个孔中添加100μl上述mtt溶液，然后再培养4小时，然后移除培养基，每孔添加150μl二甲基亚砜，搅拌平板10分钟，以确保福尔马赞晶体充分溶解，使用分光光度计测量490nm处的吸光度；

16、s42、细胞内ros检测：细胞渗透性染料dcfh-da用于检测ros的产生，从而使ros将非荧光染料氧化为dcf的绿色荧光，在一个典型的设置中，2×105个skov3细胞被接种并孵育一夜本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种靶向pH响应型仿生纳米粒介导的卵巢癌治疗方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种靶向pH响应型仿生纳米粒介导的卵巢癌治疗方法，其特征在于：在S1中，精密称取适量醋酸锰、亚砷酸钠，分别制成醋酸锰溶液、亚砷酸钠溶液，精密称取适量葡萄糖氧化酶，加入50ul醋酸锰溶液混合后一同加入一份有机相，50ul亚砷酸钠溶液加入另一份有机相，分别使用探头超声2分钟得到乳液，将两份乳液轻轻混合后加入10mL水中探头超声2分钟，随后40℃旋转蒸发20分钟除去二氯甲烷，离心得到纳米粒，采用细胞膜提取试剂盒提取SKOV3细胞的细胞膜，与适量纳米粒超声混合一段时间后制成AMGNPS@SKOV3。

3.根据权利要求1所述的一种靶向pH响应型仿生纳米粒介导的卵巢癌治疗方法，其特征在于：在S2中，取等量离心得到的纳米粒放入透析袋(MW＝3500Da)中，在pH值为7.4和5.6的条件下，将含有纳米粒的透析袋浸入10mL PBS溶液中，以模拟正常生理条件及肿瘤组织微环境，然后在37℃下对系统进行磁搅拌，在预先设计的时间点取1mL释放介质，并再添加1mL新鲜PBS，

4.根据权利要求1所述的一种靶向pH响应型仿生纳米粒介导的卵巢癌治疗方法，其特征在于：在S3中，在进行体外酸度实验时，取5ml的4mg/ml的葡萄糖溶液于小烧杯中，并使用37℃的烘箱预热30min，分别加入50ul的AMGNPS和AMNPS后，在磁力搅拌器中均匀搅拌，保持37℃，用pH计检测不同时间点反应液的pH，准备若干个样品瓶，在每个样品瓶中加入同等浓度和体积的AMGNPS溶液，然后依次加入不同浓度的葡萄糖溶液，静置孵育4h后，使用pH计测定每个样品瓶中溶液的pH值。

5.根据权利要求1所述的一种靶向pH响应型仿生纳米粒介导的卵巢癌治疗方法，其特征在于：在S3中，在进行过氧化氢浓度检测时，将100ulAMGNPS和50ul不同浓度葡萄糖依次加入300ul醋酸盐缓冲液反应30min，随后再加入50ulTMB，立即将此混合液置于37℃水浴中反应15min，反应结束后用紫外分光光度计测定溶液在652nm处的吸光度值；使用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺验证羟基自由基的产生，在羟基自由基存在下，TMB在650nm处的吸收增强，将不同pH值的800μL AMGNPS、MGNPS、AGNPS溶液与20μL30％过氧化氢和100μL TMB混合，4h后，使用紫外分光光度计测定400～800nm的吸光度。

6.根据权利要求1所述的一种靶向pH响应型仿生纳米粒介导的卵巢癌治疗方法，其特征在于：在S4中，细胞在37℃和5％CO2下培养12小时，在制备纳米粒时用荧光染料罗丹明标记，然后用含有游离罗丹明染料、AMGNPS、AMGNPS@SKOV3的新培养基替换培养基，然后分别培养1或4小时，随后，用PBS洗涤细胞3次，用4％多聚甲醛固定，并用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚染色，以便用CLSM观察，并用流式细胞术对其进行定量分析。

7.根据权利要求1所述的一种靶向pH响应型仿生纳米粒介导的卵巢癌治疗方法，其特征在于：在S4中，在对细胞的检测和分析还包括以下内容：

8.根据权利要求1所述的一种靶向pH响应型仿生纳米粒介导的卵巢癌治疗方法，其特征在于：在S5中，将0.3mLRBC混悬液与1.2mLAMGNPS@SKOV3混合于PBS中，放置3h后，离心，收集上清液，在541nm处进行UV/Vis吸收分析。

9.根据权利要求8所述的一种靶向pH响应型仿生纳米粒介导的卵巢癌治疗方法，其特征在于：在S5中，活体MRI成像时，瘤内注射0.5mLAMGNPS@SKOV3，锰浓度为3mg/kg，随后，在注射后1、2、4、8和12h用1.5T单位MRI系统记录MRI图像。

10.根据权利要求8所述的一种靶向pH响应型仿生纳米粒介导的卵巢癌治疗方法，其特征在于：在S6中，对小鼠进行活体荧光检测，观察药物在小鼠体内的分布情况；治疗结束后，处死小鼠，取肿瘤组织和主要器官做HE染色，对染色结果进行分析。

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【技术特征摘要】

1.一种靶向ph响应型仿生纳米粒介导的卵巢癌治疗方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种靶向ph响应型仿生纳米粒介导的卵巢癌治疗方法，其特征在于：在s1中，精密称取适量醋酸锰、亚砷酸钠，分别制成醋酸锰溶液、亚砷酸钠溶液，精密称取适量葡萄糖氧化酶，加入50ul醋酸锰溶液混合后一同加入一份有机相，50ul亚砷酸钠溶液加入另一份有机相，分别使用探头超声2分钟得到乳液，将两份乳液轻轻混合后加入10ml水中探头超声2分钟，随后40℃旋转蒸发20分钟除去二氯甲烷，离心得到纳米粒，采用细胞膜提取试剂盒提取skov3细胞的细胞膜，与适量纳米粒超声混合一段时间后制成amgnps@skov3。

3.根据权利要求1所述的一种靶向ph响应型仿生纳米粒介导的卵巢癌治疗方法，其特征在于：在s2中，取等量离心得到的纳米粒放入透析袋(mw＝3500da)中，在ph值为7.4和5.6的条件下，将含有纳米粒的透析袋浸入10ml pbs溶液中，以模拟正常生理条件及肿瘤组织微环境，然后在37℃下对系统进行磁搅拌，在预先设计的时间点取1ml释放介质，并再添加1ml新鲜pbs，测量释放介质中药物在不同时间段内的浓度，并对游离as3+和游离mn2+的体外释放进行比较。

4.根据权利要求1所述的一种靶向ph响应型仿生纳米粒介导的卵巢癌治疗方法，其特征在于：在s3中，在进行体外酸度实验时，取5ml的4mg/ml的葡萄糖溶液于小烧杯中，并使用37℃的烘箱预热30min，分别加入50ul的amgnps和amnps后，在磁力搅拌器中均匀搅拌，保持37℃，用ph计检测不同时间点反应液的ph，准备若干个样品瓶，在每个样品瓶中加入同等浓度和体积的amgnps溶液，然后依次加入不同浓度的葡萄糖溶液，静置孵育4h后，使用ph计测定每个样品瓶中溶液的ph值。

5.根据权利要求1所述的一种靶向ph响应型仿生纳米粒介导的卵巢癌治疗方法，其特征在于：在s3中，在进行过氧化氢浓度检测时，将100ulamgnps和50ul不同浓度葡萄糖依次加入300ul醋酸盐缓...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶柔美，叶明珠，齐忠权，王云，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：

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