【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物基因工程，更具体的说是涉及苄基异喹啉生物碱及衍生物合成基因acnmt1、蛋白、应用及筛选方法。
技术介绍
1、北马兜铃是中药材马兜铃的来源物种之一，是一味功效良好的止咳平喘祛痰药，含有多种苄基异喹啉生物碱，如木兰花碱、马兜铃酸及其衍生物。由于其含有较多的马兜铃酸，2020版《中国药典》已将马兜铃删去。在此之前，药典已经陆续删除了青木香、天仙藤、广防己、关木通这几种马兜铃酸药材。这些药材大多使用历史悠久，疗效显著且无良好的药材替代品。由于马兜铃酸具有显著的肾毒性和致癌性，该成分限制了此类药材的使用。
2、为了安全适当地使用这些药材，将马兜铃酸彻底从中去除十分关键。目前马兜铃酸类药材的减毒方法主要有：炮制、配伍和传统育种，但上述方法均存在成本高，耗时久，或者难于定量检测，不利于监管等缺点。分子育种是改良药材品种的有效方式之一，将马兜铃酸的生物合成途径彻底掌握后，理论上可以将该成分从药材中彻底去除。
3、马兜铃酸属于苄基异喹啉生物碱衍生物，马兜铃酸的上游合成路径与苄基异喹啉生物碱合成路径相重合。且苄基异喹啉生物碱是一类具有重要药用价值的代谢物。研究其共同合成通路上的关键酶的功能，有助于使用分子育种手段去除药材中马兜铃酸成分和提高苄基异喹啉生物碱药效成分，也为马兜铃酸药材中的苄基异喹啉生物碱活性成分的合成生物学应用奠定基础。
4、因此，如何提供苄基异喹啉生物碱及衍生物合成基因acnmt1并研究其生物解析途径以应用于药材的减毒中是本领域技术人员亟需解决的问题。
<
1、有鉴于此，本专利技术提供了苄基异喹啉生物碱及衍生物合成基因acnmt1、蛋白、应用及筛选方法。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、一种苄基异喹啉生物碱及衍生物合成基因acnmt1，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
4、一种苄基异喹啉生物碱及衍生物合成基因acnmt1，该基因编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
5、进一步的，acnmt1基因的全长扩增引物如下：
6、 引物名称 引物序列(5’-3’) acnmt1-f(seq id no.3) ggatccatggcgcctgagaaactgaac acnmt1-r(seq id no.4) gcggccgcttttttcttgaaaagtag
7、所述的基因acnmt1在生物合成途径解析、药效成分的生物合成或分子改良育种任一中的应用。
8、苄基异喹啉生物碱及衍生物合成基因acnmt1的筛选方法，筛选步骤如下：
9、1)基于北马兜铃基因组，筛选北马兜铃nmt基因家族成员，构建进化树，分析与其他物种nmt之间的进化关系，初筛北马兜铃苄基异喹啉生物碱氮甲基转移酶关键基因；
10、2)基于北马兜铃根、茎、叶、花的转录组数据和马兜铃酸含量，分析差异基因的表达，进一步筛选北马兜铃苄基异喹啉生物碱氮甲基转移酶关键基因。
11、进一步地，所述步骤1)的具体操作为：在ncbi数据库中搜索罂粟、日本黄连、麻黄、黄唐松草、花菱草、黄花海罂粟和大红罂粟中已知功能的cjcnmt、tfcnmt、tfpavnmt、psrnmt、pstnmt、psnmt4、ectnmt、gflnmt、pbtnmt 9个蛋白质序列，将上述9个酶蛋白序列作为初始查询序列，利用tblastn程序本地搜索北马兜铃核酸数据库，获得北马兜铃acnmt序列；
12、将acnmt蛋白序列与苄基异喹啉生物碱合成相关的其他物种的nmt蛋白序列一同经过muscle比对，构建nj系统进化树，bootstrap选择重复1000次；
13、重点关注与cnmt和rnmt聚在一起的10条acnmt，acnmt1-10；根据转录组数据，提取10条acnmt在不同组织中的表达量fpkm值，绘制热图。
14、进一步地，步骤1)中，所述其他物种的nmt蛋白序列包括pscnmt，ay217336；psrnmt，kx369612；psnmt4，kx369613；pstnmt，q108p1；cjcnmt，ab061863；ectnmt，eu882977；tfcnmt，ay610508；tfpavnmt，eu883010；pbtnmt，eu882994。
15、进一步地，步骤2)中所述分析差异基因的表达为依据步骤1)中绘制出的热图对北马兜铃根、茎、叶、花的转录组数据和马兜铃酸含量进行比较。
16、苄基异喹啉生物碱及衍生物合成基因acnmt1的功能验证，验证方法如下：
17、1)将acnmt1编码基因克隆至载体中形成重组表达载体，将重组表达载体与空载体分别转化至大肠杆菌表达菌株中；
18、2)取过夜活化的菌液加入lb液体培养基中培养，待其od值达到0.6-0.8时，加入iptg使其终浓度为0.5mm，开始进行诱导；
19、3)诱导20h后，离心收集菌体，超声破碎，取上清；
20、4)将上清液经0.45μm滤膜过滤，上样至平衡好的ni柱中，用清洗缓冲液洗三次，洗脱缓冲液洗三次，收集洗脱液，用超滤管浓缩至500μl，得纯化的蛋白酶液；
21、5)配制反应体系对纯化蛋白酶液进行验证，将反应体系孵育1h，50μl甲醇混匀后终止反应，离心后过0.22μm滤膜，使用uplc检测其化学成分，根据色谱图和质谱图进行分析。
22、进一步地，步骤5)中，所述反应体系包括25mm tris-hcl(ph 8.0)、25mm维生素c钠、0.1mm s-腺苷甲硫氨酸、10μg纯化后的蛋白、100mm底物；
23、所述底物包括(s)-去甲乌药碱、(s)-乌药碱、(s)-3’-羟基乌药碱、(s)-n-甲基乌药碱、(s)-牛心果碱；
24、所述uplc检测为使用acquity uplc beh c18色谱柱(2.1x100nm，1.7μm；waters)；检测波长：280nm；柱温：35℃；流速：0.3ml min-1，进样量；10μl；流动相：甲醇(a)，0.1％甲酸水(b)；梯度洗脱条件为：0-0.5min,保持5％a；0.5-4min，5％a增长至95％a；4-6min，保持95％a；6-6.1min，95％a降低至5％a；6.1-8min，保持5％a。
25、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开了苄基异喹啉生物碱本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种苄基异喹啉生物碱及衍生物合成基因AcNMT1，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID No.1所示。
2.权利要求1所述的基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸的序列如SEQ ID No.2所示。
3.敲除权利要求1所述的基因AcNMT1在植物育种中的应用，其特征在于，所述植物育种为选育不包含马兜铃酸的植物品种。
4.一种扩增权利要求1所述的基因AcNMT1的引物组，其特征在于，序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示。
5.权利要求4所述的引物组在鉴定AcNMT1基因中的应用。
6.权利要求1所述的苄基异喹啉生物碱及衍生物合成基因AcNMT1的筛选方法，其特征在于，筛选步骤如下：
7.如权利要求6所述的苄基异喹啉生物碱及衍生物合成基因AcNMT1的筛选方法，其特征在于：
8.如权利要求6所述的苄基异喹啉生物碱及衍生物合成基因AcNMT1的筛选方法，其特征在于：
9.如权利要求6所述的苄基异喹啉生物碱及衍生物合成基因AcNMT1的筛选方法，其特征在于：<...
【技术特征摘要】
1.一种苄基异喹啉生物碱及衍生物合成基因acnmt1，其特征在于，其核苷酸序列如seqid no.1所示。
2.权利要求1所述的基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸的序列如seq id no.2所示。
3.敲除权利要求1所述的基因acnmt1在植物育种中的应用，其特征在于，所述植物育种为选育不包含马兜铃酸的植物品种。
4.一种扩增权利要求1所述的基因acnmt1的引物组，其特征在于，序列如seq id no.3～seq id no.4所示。
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。