【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药，涉及一种改造的免疫效应细胞，尤其是一种通用型t细胞，及其在治疗肿瘤和自身免疫性疾病中的应用。
技术介绍
1、嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor t-cell，car-t)免疫疗法是当今极具前景的免疫治疗方法，在很多晚期癌症的临床iii期试验中均显示出更高的生存率。目前，该疗法已有产品实现商业化并获得美国食品药物管理局认证，包括2017年批准的kymriah和yescarta，以及2020年批准的tecartus。
2、car的基本结构通常包括一个肿瘤相关抗原(tumour-associated antigen，taa)结合区，一个跨膜区和一个胞内信号传导区。car可直接靶向肿瘤表面taa，激活car-t细胞，释放穿孔素/颗粒酶素b，杀灭肿瘤细胞。现阶段car-t疗法的t细胞多取自病人自身外周血，在体外通过基因编辑技术将car嵌合于t细胞表面并于体外进行大量扩增，随后，car-t细胞被重新注射入病人体内治疗疾病。尽管此种自体car-t疗法已取得了巨大成功，但其应用范围十分有限。首先，这种“个性化”治疗方案非常昂贵，例如kymriah需要$475，000，远超普通家庭的承受范围。其次，自体car-t细胞的制备约需三周，而某些重病病人可能会在制备过程中病情极度恶化甚至死亡。第三，由于疾病或前期治疗(如：放疗和化疗)，病人体内的t细胞数量可能较少，或t细胞质量较差，难以达到制备中对t细胞的要求。现阶段自体car-t疗法疗效或因人而异，且较难评估。
3、因
4、针对通用型car-t细胞gvhd的主要解决方案包括对t细胞的基因改造。由于gvhd的发生主要与αβt细胞表面受体(t cell receptor，tcr)有关，现有研究多致力于通过各种基因工具如transcription activator-like effector nuclease，talens，crispr-cas9等敲除t细胞表面αβtcr。第一例利用异体αβtcr-car-t细胞进行癌症治疗见于2015年，poirot与qasim等通过talens敲除t细胞表面αβtcr与cd52，在nsg小鼠中可清除b-all肿瘤，且未见明显gvhd。两年后，qasim等将此技术成功应用于临床，于分子水平治愈了两名13个月左右b-all婴儿，且未见gvhd。近年来，构建tcr-car-t已成为通用型car-t解决gvhd的普遍策略。并且，由于基因编辑技术(e.g.crispr-cas9)以及将car引入细胞的病毒(e.g.腺相关病毒，adeno-associated virus，aav)或非病毒载体的迅速发展，研究人员已可逐渐实现对αβtcr的高效敲除以及在特定位点精准引入car。例如，eyquem等人使用crispr-cas9在αβtcr的trac位点形成缺口，利用homologous recombination template修复原理以aav为载体将car准确引入trac位点，同时破坏αβtcr locus结构。此一步“敲除tcr+敲入car”方法降低了car自激活信号，内化car的表达，减缓了效应t细胞的分化与耗竭，且最后提升了car-t细胞的抗肿瘤能力，是现今通用型car-t制备的主流方法之一。
5、通用型car-t细胞的第二重要问题是异体car-t细胞由于表达自身hla，会被受体细胞，尤其是受体t细胞识别、攻击并排斥，即发生hvgr，从而影响供体car-t细胞在体内的增殖和抗肿瘤效果。目前，除了传统hla配型或植入car-t细胞前清髓等措施之外，hvgr的解决主要有两大方向，第一是使car-t细胞hla相对受体免疫系统“隐形”，例如通过敲除β2微球蛋白构建hla-i分子缺失的car-t细胞解决排斥。然而，hla-i的缺失使其更易受到受体nk细胞的攻击，因而，此类hla-i分子缺失的car-t受到nk细胞的排斥将极大增高。若要从hla角度解决排斥，或需要更复杂的基因编辑工作，如在t细胞表面表达非经典hla(如：hla-e和hla-g)，或siglec-7、-9等，以逃避nk细胞介导的排斥反应。但过多的基因编辑存在较大安全隐患，如更大的脱靶效应和细胞毒性等等。除此之外，解决hvgr的另一思路着重于抑制受体免疫系统，尤其是t细胞。诸如在car-t细胞上表达某些可与激活淋巴细胞标记物相互结合的分子可抑制受体激活淋巴细胞对car-t细胞的排斥，达到逃避受体排斥的作用。例如，41bb是激活淋巴细胞标记物之一，mamonkin研究组通过在car-t细胞表面表达41bb受体，可抑制受体淋巴系统对其的识别和攻击，延长了car-t细胞在病人体内的存活时间，也为后续car-t细胞在病人体内持续存在且提供免疫监视奠定了重要的基础。然而，由于此类car-t细胞可无差别识别激活淋巴细胞标记物，会持续抑制受体淋巴系统正常工作，安全性存疑。并且激活的car-t细胞本身也会表达41bb受体，导致car-t细胞的自我杀伤，降低car-t细胞的肿瘤清除效率。遵循抑制受体免疫系统这一思路，免疫抑制药物的使用或将成为解决hvgr的新方法。例如，免疫抑制药物环孢菌素(cyclosporine a，csa)或他克莫司(tacrolimus，fk506)常用于需要干细胞移植或器官移植的疾病治疗中。其机制主要为与亲环素结合形成复合体，抑制钙调磷酸酶(calcineurin)磷酸化，抑制其核转运过程继而阻断后续nfat信号通路的激活，从而抑制t细胞活化、增殖及细胞因子(如il-2和ifn-γ)转录分泌。因此，若能使用csa/fk506抑制受者t细胞，必将极大降低受者t细胞对供者car-t细胞的hvgr反应。而且csa/fk506是防止器官移植发生排斥的一线药物，患者可终生使用，其安全性得到了充分的验证。然而，由于csa/fk506对t细胞的普遍抑制性，受者t细胞及输入的car-t细胞激活均会受到抑制，使其无法应用于car-t疗法领域。因此，需要对car-t细胞进行改造以使其能够拮抗csa/fk506的抑制作用，从而使car-t细胞行使正常的杀伤功能。
6、但是若改造后的car-t细胞长期存在也会存在引发肿瘤的隐患。因此，需要提供一种在受体免疫体系被抑制情况下依本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种通用型免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞表达外源蛋白1，所述外源蛋白1为突变型钙调蛋白磷酸酶A亚基和/或突变型钙调蛋白磷酸酶B亚基；
2.如权利要求1所述的通用型免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞进一步表达外源蛋白2，所述外源蛋白2能够识别肿瘤抗原或病原体抗原；
3.如权利要求1或2所述的通用型免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞中T细胞受体复合物、T细胞受体α恒定区蛋白、和/或T细胞受体β恒定区蛋白被敲除。
4.如权利要求1-3任一项所述的通用型免疫效应细胞，其特征在于，外源蛋白1和/或外源蛋白2的编码基因插入所述免疫效应细胞的TCR复合物的组成元件中的任一个或任意两个或以上个元件的编码基因中；
5.如权利要求1-4任一项所述的通用型免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞是T细胞或NK细胞；
6.制备权利要求1-5任一项所述通用型免疫效应细胞的方法，其特征在于，对免疫效应细胞进行工程化改造，得到表达外源蛋白1的通用型免疫效应细胞；
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于
8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-5任一项所述的通用型免疫效应细胞，以及免疫抑制剂；
9.权利要求1-5任一项所述的通用型免疫效应细胞在制备抗肿瘤或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。
10.权利要求1-5任一项所述的通用型免疫效应细胞联合免疫抑制剂在制备抗肿瘤或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途；
11.权利要求1-5任一项所述的通用型免疫效应细胞在制备与免疫抑制剂联用的抗肿瘤或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途；
12.权利要求9-11任一项所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自白血病(如急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病，急性粒细胞白血病，急性早幼粒细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性白血病、慢性白血病、慢性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、真性红细胞增多症)，淋巴瘤(霍奇金病、非霍奇金病)、原发性巨球蛋白血症，重链病，实体瘤如肉瘤和癌症(如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、血管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤，滑膜vioma，间皮瘤，尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、支气管癌、髓样癌、肾细胞癌、肝癌，尼罗河管癌，绒癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤，颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤，听神经瘤，少突胶质瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤)、食管癌、胆囊癌、肾癌、多发性骨髓瘤；较佳地，所述的“肿瘤”包括但不限于：胰腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、淋巴瘤、胆囊癌、肾癌、白血病、多发性骨髓瘤、卵巢癌、宫颈癌和胶质瘤；所述自身免疫性疾病选自：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、中轴型脊椎关节炎、重症肌无力、多发性肌炎、牛皮癣/银屑病、天疱疮、白癫风、多发性硬化症、嗜睡症、视神经脊髓炎、一型糖尿病、甲亢、桥本氏病/甲低、Sjogren’s syndrome、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、自身免疫性胃炎、原发性胆道胆管炎、自身免疫性肝炎、狼疮性肾炎、肺出血-肾炎综合征、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎。
...【技术特征摘要】
1.一种通用型免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞表达外源蛋白1，所述外源蛋白1为突变型钙调蛋白磷酸酶a亚基和/或突变型钙调蛋白磷酸酶b亚基；
2.如权利要求1所述的通用型免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞进一步表达外源蛋白2，所述外源蛋白2能够识别肿瘤抗原或病原体抗原；
3.如权利要求1或2所述的通用型免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞中t细胞受体复合物、t细胞受体α恒定区蛋白、和/或t细胞受体β恒定区蛋白被敲除。
4.如权利要求1-3任一项所述的通用型免疫效应细胞，其特征在于，外源蛋白1和/或外源蛋白2的编码基因插入所述免疫效应细胞的tcr复合物的组成元件中的任一个或任意两个或以上个元件的编码基因中；
5.如权利要求1-4任一项所述的通用型免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞是t细胞或nk细胞；
6.制备权利要求1-5任一项所述通用型免疫效应细胞的方法，其特征在于，对免疫效应细胞进行工程化改造，得到表达外源蛋白1的通用型免疫效应细胞；
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)获取和培养健康人t细胞；2)敲除t细胞中的tcr；3)将car和突变型cna和/或突变型cnb转入t细胞；4)分离得到表达突变型cna和/或突变型cnb和car，而且tcr表达下调或不表达的通用型car t细胞；
8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-5任一项所述的通用型免疫效应细胞，以及免疫抑制剂；
9.权利要求1-5任一项所述的通用型免疫效应细胞在制备抗肿瘤或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。
10.权利要求1-5任一项所述的通用型免疫效应细胞联合免疫抑制剂在制备抗肿瘤或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途；
11.权利要求1-5任一项所述的通用型免疫效应细胞...
【专利技术属性】
技术研发人员：曾浔，方宏玉，张毅茜，王国璨，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属第一医院，
类型：发明
国别省市：
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