【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于化合物的合成，具体而言，涉及一种酶法合成1,2-己二醇的方法。
技术介绍
1、1,2-己二醇是一种有机物，化学式为c6h14o2，外观为透明无色至淡黄色液体。1,2-己二醇能以任何比例与多种有机化合物混合，无腐蚀性，广泛用于彩色喷墨打印机的油墨、制造化妆品、多用途清洁剂。按其应用领域，1,2-己二醇可分为医药级、化工级、化妆品级等。1,2-己二醇，同时具有疏水性和亲水性的特征，常用于化妆品及医药品中起到溶剂、渗透助剂的作用，且具有一定的保湿及防腐功效。
2、1,2-己二醇的合成一般以1-己烯为起始物，经氧化剂环氧化和水解两个过程生成1,2-己二醇。或以己酸为起始物，经氯代和水解生成2-羟基己酸，再通过羧基还原生成1,2-己二醇。目前的α-羟基化需要两步化学合成，且需要被列入《危险化学品名录》中的氯气，如果能通过酶法一步实现α-羟基化，则会降低生产成本，且更加温和、绿色、低危险。现有报道酶法实现α-羟基化的酶特异性不高，除了α位羟基化还有大量其他位点羟基化，或者底物及产物浓度极低，无法满足工业化生产。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术提供了一种酶法合成1,2-己二醇的方法。本专利技术提供的酶法合成1,2-己二醇的方法，反应环境温和，过程简单可控，生产过程绿色环保，具有良好的工业化应用前景。
2、本专利技术的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
3、本专利技术的一个方面提供了一种酶法合成1,2-己二醇的方法，所
4、s1：构建p450单加氧酶菌株，由p450单加氧酶菌株产p450单加氧酶，并将p450单加氧酶纯化；
5、s2：通过p450单加氧酶催化正己酸生成2-羟基己酸；
6、s3：通过脂肪酶在丁醇存在的条件下催化2-羟基己酸生成1,2-己二醇。
7、进一步地，步骤s1中所述p450单加氧酶菌株的构建方法如下：
8、以枯草芽孢杆菌bacillus subtilis wb800n基因组为模板，使用引物ybdt-f和ybdt-r扩增，获得ybdt片段，将所得的片段胶回收后接到pbad hisb载体上，转化大肠杆菌fast-t1感受态，在含氨苄青霉素的lb平板上筛选阳性克隆，并用引物pbad-f测序验证；
9、将测序正确的质粒转入到大肠杆菌bw25113感受态细胞中，得到基因工程菌bw/pbad-ybdt。
10、进一步地，所述引物ybdt-f的核苷酸序列如seq id no:3所示，所述引物ybdt-r的核苷酸序列如seq id no:4所示；所述引物pbad-f的核苷酸序列如seq id no:5所示；
11、pcr扩增体系为：5×sf buffer 10ul、dntp mix(10mm each)1ul、模板bacillussubtilis wb800n基因组1μl、引物(10um)各2ul、phanta super-fidelity dna polymerase1ul、蒸馏水34ul，总体积为50μl；
12、所述扩增条件为：95℃预变性2分钟，1个循环；95℃变性10秒、55℃退火20秒、72℃延伸1.5分钟，30个循环；72℃延伸10分钟，1个循环。
13、进一步地，步骤s1中所述由p450单加氧酶菌株产p450单加氧酶的具体过程为：
14、将得到的基因工程菌bw/pbad-ybdt接种至2yt液体培养基中，于37℃培养4-6h，之后将所得培养液按1％-2％的接种量接种至摇瓶中，于37℃，200rpm培养2-3h后，用最终浓度为1wt％-2wt％的阿拉伯糖诱导产酶，诱导温度为25℃-30℃，诱导转速为220rpm，诱导时间为14-18h，之后离心分离，收集培养基中的细胞产物；
15、所述2yt液体培养基成分为：分子级蛋白胨9-11g/l，分子级酵母粉4-6g/l，nacl4-6g/l，氨苄青霉素100μg/ml，ph为6.8-7.2。
16、进一步地，步骤s1中所述p450单加氧酶的纯化方法为：
17、在所述收集到的细胞产物中加入20ml 1×pbs，ph 7.4重新悬浮细胞，超声破碎细胞，在冰上进行操作，破碎1秒，冷却3秒，总时间为30-45分钟；4℃，10000rpm离心裂解液30分钟，以沉淀细胞碎片，收集上清液，过0.45μm的滤膜，之后过ni-nta亲和层析，得到洗脱液；
18、将收集到的洗脱液用10kda的超滤管超滤浓缩脱盐，期间补充1×pbs，ph 7.4，4℃，4000rpm离心5次，最后一次浓缩完成后不加pbs，获得纯化后的p450单加氧酶ybdt酶。
19、优选地，上述亲和层析过程为：将含多聚组氨酸标签蛋白的澄清样品上样至柱中，流速控制为0.5-1ml/min，收集流出液再次过柱；以流速为1ml/min的pbs洗涤柱子以去除杂蛋白，一般用量为5倍柱体积，以流速为1ml/min的含20mm咪唑洗涤缓冲液洗涤柱子以去除杂蛋白，一般用量为8倍柱体积；用5-10倍柱体积的含250mm咪唑洗脱缓冲液以0.5-1ml/min的流速洗脱，收集得到洗脱液。
20、进一步地，所述p450单加氧酶具有如下特征：
21、(1)具有如seq id no:2所示的氨基酸序列；
22、(2)如(1)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(1)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或
23、(3)与(1)或(2)所属氨基酸序列的多肽具有至少70％、至少80％或至少90％的序列同一性的突变体多肽且所述片段仍然具有催化正己酸生成2-羟基己酸的活性。
24、进一步地，步骤s2中所述通过p450单加氧酶催化正己酸生成2-羟基己酸的具体过程为：
25、将正己酸、h2o2、ph 7.5tris-hcl、p450单加氧酶以及乙醇混合后于25-37℃下反应12-24h，之后加入十分之一hcl终止反应，按照样品：乙酸乙酯体积比1:1的量取1ml样品加入1ml乙酸乙酯，超声10min后，10000rpm离心10min，2-羟基己酸在上层清液中。
26、优选地，通过气相色谱对上述上清液进行检测，具体过程为：
27、仪器：岛津gc-2014
28、色谱柱：rtx-5，长度30m，内径0.32mmid，膜厚0.25μm，最高温度350℃；
29、进样体积：1ul，气化室温度：300℃，分流，载气：n2，控制模式：压力
30、压力：105.0kpa，总流量：82.5ml/min，色谱柱流量：3.79ml/min；线速：55.8cm/sec；吹扫流量:3.0ml/min；分流比：20.0色谱柱温度：60℃；平衡时间：2.0min；检测器温度：320℃；结束时间：31min。
31、进一步地，所述正己酸的浓本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种酶法合成1,2-己二醇的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述P450单加氧酶菌株的构建方法如下：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述引物ybdT-F的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示，所述引物ybdT-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述引物PBAD-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述由P450单加氧酶菌株产P450单加氧酶的具体过程为：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述P450单加氧酶的纯化方法为：
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述P450单加氧酶具有如下特征：
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述通过P450单加氧酶催化正己酸生成2-羟基己酸的具体过程为：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述正己酸的浓度为0.02-0.3M，H2O2的初始浓度为0.2-1.5mM
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中所述通过脂肪酶在丁醇存在的条件下催化2-羟基己酸生成1,2-己二醇具体过程为：
...【技术特征摘要】
1.一种酶法合成1,2-己二醇的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中所述p450单加氧酶菌株的构建方法如下：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述引物ybdt-f的核苷酸序列如seq idno:3所示，所述引物ybdt-r的核苷酸序列如seq id no:4所示；所述引物pbad-f的核苷酸序列如seq id no:5所示；
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤s1中所述由p450单加氧酶菌株产p450单加氧酶的具体过程为：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤s1中所述p450单加氧酶的纯化方法为：
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【专利技术属性】
技术研发人员：邱媛媛，张莎莎，史鲁秋，薛虹宇，李华山，
申请(专利权)人：南京盛德创赢生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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