新型双重辅助质粒制造技术

技术编号：40315140 阅读：5 留言：0更新日期：2024-02-07 20:56

本公开涉及一种用于生产重组腺相关病毒的双重辅助质粒。与通常用于生产腺相关病毒的三重转染方法相比，采用本公开所述双重辅助质粒的双重转染方法在以下方面具有优势：1)增加共转染可能性；2)提高重组腺相关病毒的生产率；3)减少质粒生产和纯化的成本和时间；等等，因此可有效地用于基因治疗剂的有效生产。

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【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】

本公开涉及一种用于生产基因递送用重组aav的新型双重辅助质粒。

技术介绍

1、腺相关病毒(aav)是单链dna病毒，属于辅助病毒依赖型细小病毒，需要腺病毒等辅助病毒的帮助才能增殖。它是一种基因组大小约为4.7kbp的非病原性病毒，不会诱导细胞介导免疫应答。感染靶标根据血清型而广泛变化，而该病毒可以向非分裂和分裂细胞递送基因。特别是，aav所递送基因的表达在体内持久存在[1-3]。

2、通常，通过宿主细胞(例如hek293细胞)的三重转染产生重组腺相关病毒[4]。这一过程需要使用：1)aav构建体质粒，具有两端为itr(反向末端重复序列)的基因表达盒；2)“rep-cap质粒”，提供腺相关病毒基因组复制所需的rep蛋白和构成病毒颗粒的衣壳蛋白；以及3)“辅助质粒”，提供帮助腺相关病毒完成生命周期的腺病毒蛋白(e2a、e4)和rna(varna)。这三类质粒转染到提供腺病毒e1和e3基因的hek293等细胞中时，产生腺相关病毒[5]。

3、仅在用所有上述三种质粒转染的细胞中才能产生重组腺相关病毒载体。如果将两种质粒合为一体，进行双重转染，则共转染可能性增加，重组腺相关病毒的生产收率随之增加[6，7]。此外，由于生产重组腺相关病毒所需的质粒数量从三种减少到两种，生产和纯化质粒所需的时间和成本减少[8]。

4、重组腺相关病毒载体不保留rep和cap基因，也不具有源自腺病毒的基因，因此不能在体内复制[9]。

5、然而，由于rep、cap、e2、e4和va rna基因在质粒中的相对位置根据制备

6、因此，我们迫切需要设计一种可增加重组腺相关病毒载体的转染可能性，从而提高重组腺相关病毒的生产率，同时减少质粒生产和纯化的时间和成本的工程化双重辅助质粒及其制备方法。

7、相关技术的参考文献

8、非专利文件

9、1.biodrugs.2017.31(4):317-334.adeno-associated virus(aav)as avectorfor gene therapy(《生物药物》.2017.31(4):317-334.腺相关病毒作为基因治疗载体).m.f.naso,b.tomkowicz,w.l.perry 3rd,w.r.strohl.

10、2.expert opin.drug saf.2002.1(1):79-91.safety of adeno-associatedviral gene therapy vectors:a current evaluation(《药品安全专家意见》.2002.1(1):79-91.腺相关病毒基因治疗载体的安全性：现状评价).p.e.monahan,k.jooss,m.s.sands.

11、3.gene ther.1996.3(8):658-68.safety of single-dose administration ofan adeno-associated virus(aav)-cftr vector in the primate lung(《基因治疗》.1996.3(8):658-68.在灵长类肺中单剂量给予腺相关病毒cftr载体的安全性).c.k.conrad,s.s.allen,s.a.afione,t.c.reynolds,s.e.beck,m.fee-maki,x.barrazza-ortiz,r.adams,f.b.askin,b.j.carter,w.b.guggino,t.r.flotte.

12、4.j.virology.1998.72(3):2224-2232.production of high-titerrecombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helperadenovirus(《病毒学期刊》.1998.72(3):2224-2232.在辅助腺病毒不存在的情况下生产高滴度重组腺相关病毒载体).

13、5.viruses.2010.2(8):1681-1703.adenoviral producer cells(《病毒》.2010.2(8):1681-1703.腺病毒生产细胞).

14、6.hum.gene ther.1998.9(18):2745-2760.novel tools for production andpurification of recombinant adeno-associated virus vectors(《人类基因治疗》.1998.9(18):2745-2760.用于生产和纯化重组腺相关病毒载体的新型工具).

15、7.mol.ther.2003.7(6):839-850.helper virus-free,opticallycontrollable,and two-plasmid-based production of adeno-associated virusvectors of serotypes 1to 6(《分子治疗》.2003.7(6):839-850.无辅助病毒、光学可控、基于两种质粒的血清型1-6腺相关病毒载体的生产).d.grimm,m.a.kay,j.a.kleinschmidt.

16、8.biores.open access.2020.9(1):219-228.two-plasmid packaging systemfor recombinant adeno-associated virus(《生物学研究开放存取》.2020.9(1):219-228.重组腺相关病毒的双质粒包装系统).q.tang,a.m.keeler,s.zhang,q.su,z.lyu,y.cheng,g.gao,t.r.flotte.

17、9.hum.gene ther.2017.28(11):1075-1086small but increasingly mighty:latest advances in aav vector research,design,and evolution(《人类基因治疗》.2017.28(11):1075-1086.微小但日益强大：aav载体研究、设计和发展的最新进展).d.grimm,h.buening.

技术实现思路

1、技术方案

2、本专利技术提供了一种双重辅助质粒，包含e2a基因、e4基因、va rna基因和rep-cap基因，其中，所述e2a、e4和va rna基因依次连接，所述rep-cap基因以顺时针方向(从5'到3')位于e2a基因5'端与va rna基因3'端之间。

3、本专利技术提供了一种双重辅助质粒，包含e2a基因、e4基因、va rna基因和rep-cap基因，其中，所本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种双重辅助质粒，包含E2a基因、E4基因、VA RNA基因和rep-cap基因，其中，所述E2a、E4和VA RNA基因依次连接，所述rep-cap基因以顺时针方向(从5'到3')位于E2a基因5'端与VA RNA基因3'端之间。

2.根据权利要求1所述的双重辅助质粒，其中，所述rep-cap基因5'端与E2a基因5'端连接，所述rep-cap基因3'端与VA RNA基因3'端连接。

3.一种双重辅助质粒，包含E2a基因、E4基因、VA RNA基因和rep-cap基因，其中，所述E2a、E4和VA RNA基因依次连接，所述rep-cap基因以逆时针方向(从3'到5')位于E2a基因5'端与VA RNA基因3'端之间。

4.根据权利要求3所述的双重辅助质粒，其中，所述rep-cap基因3'端与E2a基因5'端连接，所述rep-cap基因5'端与VA RNA基因3'端连接。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的双重辅助质粒，其中，所述rep-cap基因包含rep基因和cap基因，所述rep基因3'端与cap基因5'端连接。