【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程、合成生物学，涉及一种接枝率可调的胶原蛋白接枝产物及其制备方法和应用，尤其涉及重组ⅰ型、ⅱ型、ⅲ型或ⅹⅶ型胶原蛋白水凝胶的制备方法及其应用。
技术介绍
1、现在的生物材料可根据材料的来源大体分为天然生物材料和合成生物材料两大类。天然生物材料包括器官得到的胶原、葡糖胺聚糖、壳聚糖、明胶等，其免疫原性差，机械强度较差，且价格成本较高。合成生物材料主要由乳酸、羟基乙酸，普朗尼克和聚乙二醇等聚合而成，合成材料尽管在来源广泛、可塑性强、交联型、适合于规模化生产等方面具有很好的前景，但相比天然生物材料在促进细胞附着和增殖方面性能要差。且这两种原料不便于制备接枝产物，应用领域受限。
2、胶原是人体中含量最多的蛋白质，广泛分布于人体的结缔组织中，是细胞外基质的主要组分，不仅起到物理的支架结构，同时还可通过细胞外基质受体分子与细胞间实现信号传递，参与调控细胞的行为。胶原蛋白的主要功效是皮肤修护和抗衰，被应用于功效性产品、医用敷料、一般护肤品和肌肤焕活应用，此外胶原蛋白具有止血和细胞再生功能，因此也被用于医疗健康领域。但天然的胶原蛋白其物理机械性能差，性能单一，且因有较强的亲水性，在体内易被胶原酶降解等不可避免的弱点限制了它的应用。
3、针对当前胶原蛋白易降解、生物相容性差和功效不足等问题，科学家们研究发现，通过胶原蛋白的交联可增强其稳定性和功能。胶原蛋白交联可以通过不同的方法进行，其中最常用的方法是热处理或化学交联剂，目前使用最多的化学交联剂是甲基丙烯酸酐，利用甲基丙烯酸酐甲基丙烯酰化胶原蛋白生成ge
技术实现思路
1、针对现有技术中存在不足，本专利技术提供了一种接枝率可调的胶原蛋白接枝产物及其制备方法和应用。
2、本专利技术是通过以下技术手段实现上述技术目的的。
3、一种接枝率可调的胶原蛋白接枝产物，由重组胶原蛋白和甲基丙烯酸制备，借助nhs和edc，使光敏胶原蛋白接枝率达到8％-42％。
4、一种接枝率可调的胶原蛋白接枝产物的制备方法，包括如下步骤：
5、(1)称取重组胶原蛋白溶于去离子水中，得重组胶原蛋白溶液；
6、(2)取nhs加入到去离子水中，配置nhs溶液，搅匀备用；
7、取edc加入到去离子水中，配置edc溶液，搅匀备用；
8、(3)取甲基丙烯酸溶于去离子水中，然后加入步骤(2)的nhs溶液，搅拌均匀，再加入步骤(2)的edc溶液，调节ph至5-7，搅拌均匀，活化；
9、(4)将步骤(1)的重组胶原蛋白溶液和步骤(3)所得的溶液混合，在40-60℃下，反应1-4小时；待反应结束后，将反应液冷却到室温，以终止反应；
10、(5)将步骤(4)终止反应后的液体经透析，预冻过夜，冷冻干燥后，将所得的光敏胶原蛋白冻干海绵样品保存于铝箔袋中，冷藏保藏，检测接枝率。
11、步骤(1)～(4)中，重组胶原蛋白、甲基丙烯酸、nhs溶液和edc溶液的用量比例为：5g：0.3-2ml：1.65ml：1.65ml；其中，nhs溶液的体积百分浓度为5-20％，edc溶液的体积百分浓度20-80％。
12、步骤(1)中，重组胶原蛋白为重组ⅰ型胶原蛋白、重组ⅱ型胶原蛋白、重组ⅲ型胶原蛋白或重组ⅹⅶ型胶原蛋白。
13、例如，li等人通过将ⅰ型胶原蛋白用于小鼠骨髓干细胞(bmscs)培养，结果表明，通过促进bmscs增殖、增强碱性磷酸酶(alp)活性、促进细胞矿化结节和上调相关成骨基因的mrna表达而诱导细胞成骨分化。这些结果表明，ⅰ型胶原蛋白可能在骨健康相关功能食品中具有潜在的应用前景；
14、ⅱ型胶原蛋白主要分布于软骨，以及眼睛的玻璃体、角膜、神经视网膜等部位，主要功能是维护以上器官、组织的正常功能。li等人通过针刺三合阳对兔中度膝骨性关节炎软骨损伤的治疗，证实ⅱ型胶原蛋白对软骨损伤修复具有良好促进作用；
15、利用重组ⅲ型胶原蛋白制备三维多孔支架及水凝胶材料已被应用于医学组织工程领域的应用研究中。随着新型支架材料制造技术的进一步发展已被成功应用制备适用于不同用途的生物医用材料；
16、xvii型胶原蛋白作为一种跨膜糖蛋白，是表皮干细胞半桥粒的重要组成成分，主要位于毛囊球部的毛囊干细胞以及表皮和真皮连接处的表皮干细胞(esc)中，其作用是使得表皮和真皮通过基底膜带紧密连接，以促进表皮更替，稳固基底膜。liu等人研究发现xvii型胶原蛋白能促进干细胞竞争，表明col17a1高表皮干细胞不断地与col17a1细胞竞争，以消除皮肤中的应激或不适合的细胞，从而抵抗表皮细胞的老化。
17、步骤(3)中，活化时间为10min～4h。
18、步骤(2)和(3)中，所述搅匀均为：在磁力搅拌器上搅拌2-5min，转速500-1000r/min。
19、步骤(5)中，透析处理为：将终止反应后的液体置于分子量为1000-1500da的透析袋中，放入装满去离子水的水桶中，在室温下透析4-5天，每日换水3-4次，透析处理能除去甲基丙烯酸和小分子残留。
20、步骤(5)中，预冻过夜为：将透析袋中的液体转移至平皿中，在超低温冰箱中预冻过夜。
21、步骤(5)中，冷冻干燥为：将预冻好的样品快速转移至冷冻干燥机中，冷冻干燥处理3-4天。
22、步骤(5)中，冷藏保藏的温度为2-8℃。
23、本专利技术还公开了光敏胶原蛋白水凝胶，是利用上述接枝率可调的胶原蛋白接枝产物制备的。步骤为：将上述接枝率可调的胶原蛋白接枝产物冻干海绵溶于1×pbs溶液中，得光敏胶原蛋白溶液；然后加入光引发剂磷酸锂盐，紫外灯下光照一定时间，形成光交联的光敏胶原蛋白水凝胶。
24、其中，接枝率可调的胶原蛋白接枝产物冻干海绵、1×pbs溶液和磷酸锂盐的用量比为0.1～0.4g：1.6～1.9ml：4mg；
25、所述磷酸锂盐为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐。
26、紫外灯的波长405nm，光照为时间30-120s。
27、当重组胶原蛋白的种类不同时，所制备的光敏胶原蛋白水凝胶的用途也不同，应用于多种受损组织的修复与再生，包括皮肤、软骨、骨骼等。
28、本专利技术所用的重组胶原蛋白来自江苏创健医疗科技股份有限公司。
29、本专利技术的有益效果为：
30、(1)与现有的使用甲基丙烯酸酐的专利相比，本专利技术使用的甲基丙烯酸无毒更安全有效；具体对比如表1所示：
31、表1甲基丙烯酸与甲基丙烯酸酐的区别对比：
32、 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种接枝率可调的胶原蛋白接枝产物的制备方法，其特征在于，由重组胶原蛋白和甲基丙烯酸制备，借助NHS和EDC，使光敏胶原蛋白接枝率达到8％-42％。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)～(4)中，重组胶原蛋白、甲基丙烯酸、NHS溶液和EDC溶液的用量比例为：5g：0.3-2mL：1.65mL：1.65mL；其中，NHS溶液的体积百分浓度为5-20％，EDC溶液的体积百分浓度20-80％。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，重组胶原蛋白为重组Ⅰ型胶原蛋白、重组Ⅱ型胶原蛋白、重组Ⅲ型胶原蛋白或重组ⅩⅦ型胶原蛋白。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，活化时间为10min～4h。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)和(3)中，所述搅匀均为：在磁力搅拌器上搅拌2-5min，转速500-1000r/min。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，反应温度
8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，透析处理为：将终止反应后的液体置于分子量为1000-1500Da的透析袋中，放入装满去离子水的水桶中，在室温下透析4-5天，每日换水3-4次。
9.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，预冻过夜为：将透析袋中的液体转移至平皿中，在超低温冰箱中预冻过夜。
10.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，冷冻干燥为：将预冻好的样品冷冻干燥处理3-4天。
11.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，冷藏保藏的温度为2-8℃。
12.一种采用权利要求1-11任一所述的制备方法获得的接枝率可调的胶原蛋白接枝产物。
13.一种利用权利要求12所述的接枝率可调的胶原蛋白接枝产物制备的光敏胶原蛋白水凝胶。
14.如权利要求13所述的光敏胶原蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤为：
15.如权利要求14所述的光敏胶原蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，接枝率可调的胶原蛋白接枝产物冻干海绵、1×PBS溶液和磷酸锂盐的用量比为0.1～0.4g：1.6～1.9mL：4mg。
16.如权利要求14所述的光敏胶原蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，所述磷酸锂盐为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐。
17.如权利要求14所述的光敏胶原蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，紫外灯的波长405nm，光照为时间30-120s。
...【技术特征摘要】
1.一种接枝率可调的胶原蛋白接枝产物的制备方法，其特征在于，由重组胶原蛋白和甲基丙烯酸制备，借助nhs和edc，使光敏胶原蛋白接枝率达到8％-42％。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)～(4)中，重组胶原蛋白、甲基丙烯酸、nhs溶液和edc溶液的用量比例为：5g：0.3-2ml：1.65ml：1.65ml；其中，nhs溶液的体积百分浓度为5-20％，edc溶液的体积百分浓度20-80％。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，重组胶原蛋白为重组ⅰ型胶原蛋白、重组ⅱ型胶原蛋白、重组ⅲ型胶原蛋白或重组ⅹⅶ型胶原蛋白。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，活化时间为10min～4h。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)和(3)中，所述搅匀均为：在磁力搅拌器上搅拌2-5min，转速500-1000r/min。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，反应温度为40-60℃，反应时间为1-4小时。
8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，透析处理为：将终止反应后的液体置于分子量为1000-1500da的透析袋中，放入...
【专利技术属性】
技术研发人员：储筠，翟源心，刘思扬，张仕川，王欣慧，凡孝菊，钱松，
申请(专利权)人：江苏创健医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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