【技术实现步骤摘要】
本申请涉及生物检测，特别涉及一种细胞外囊泡、制备方法、药物组合物及应用。
技术介绍
1、基因治疗是通过分子生物学技术，将目的基因导入靶细胞内，纠正靶细胞错误的基因表达，从而使疾病得以治疗，是现代医学和分子生物学相结合而诞生的新兴临床医疗技术。而核酸在体外不稳定，体内易被降解，因此需要借助载体技术，理想的载体应具备稳定性、低免疫原性、组织特异性等特点。细胞外囊泡封闭的内部空间满足多种分子的装载，磷脂双分子层对外源核酸提供保护，特异性分子分布保障了低免疫原性。
2、现有技术中利用高通量的物理挤压方法实现将治疗性的小分子化合物装载到细胞外囊泡中，但是细胞转染通过不可控、无法定量的分子生物学方法，实现内源性核酸的表达；另外通过电转的方法将外源核酸装载至细胞外囊泡中，但是其影响核酸的体外稳定性，进而影响其功能性。
技术实现思路
1、鉴于此，有必要针对现有技术存在的缺陷提供一种转载过程可控且核酸的体外稳定性较高的高度表达用于诊疗的外源核酸的细胞外囊泡、快速制备方法、药物组合物及应用。
2、为解决上述问题，本申请采用下述技术方案：
3、本申请目的之一，提供了一种细胞外囊泡的制备方法，包括下述步骤：
4、对细胞外囊泡产生挤压作用，以使外源核酸载入所述细胞外囊泡中，所述细胞外囊泡浓度为1×102-1×1020particle/ml，挤压作用时间为30秒到15分钟；
5、对装载有所述外源核酸的所述细胞外囊泡进行纯化处理，以获得高度表达的用于诊
6、对高度表达的用于诊疗的外源核酸的细胞外囊泡的外源核酸进行定量。
7、在其中一些实施例中，对细胞外囊泡产生挤压作用，以使外源核酸载入所述细胞外囊泡中的步骤中，具体包括下述步骤：
8、将外源核酸与细胞外囊泡混匀后，通过纳米穿孔器对所述细胞外囊泡产生挤压作用，使所述细胞外囊泡的膜短暂开孔，从而使所述外源核酸装载入所述所述细胞外囊泡。
9、在其中一些实施例中，所述细胞外囊泡的尺寸为20nm-12μm，所述外源核酸为序列长度为4-30000的核苷酸。
10、在其中一些实施例中，所述细胞外囊泡的尺寸为30nm-200nm，所述外源核酸为序列长度为10-50的核苷酸。
11、在其中一些实施例中，所述外源核酸的浓度为10pm-10μm，所述细胞外囊泡的浓度为1×104-1×1018particle/ml，所述外源核酸与所述细胞外囊泡的体积比为1：50-1:500。
12、在其中一些实施例中，所述外源核酸的浓度为1nm-1μm，所述细胞外囊泡的浓度为1×104-1×1018particle/ml，所述外源核酸与所述细胞外囊泡的体积比为1:100-1:200。
13、在其中一些实施例中，在对装载有所述外源核酸的所述细胞外囊泡进行纯化处理，以获得高度表达的用于诊疗的外源核酸的细胞外囊泡的步骤中，具体包括下述步骤：
14、使用超滤法或rna酶法对装载有所述外源核酸的所述细胞外囊泡进行纯化处理，去除游离的核酸，以获得高度表达诊疗性核酸的细胞外囊泡。
15、在其中一些实施例中，在对高度表达的用于诊疗的外源核酸的细胞外囊泡的外源核酸进行定量的步骤中，具体包括下述步骤：
16、通过实时定量聚合酶链反应或微滴式数字聚合酶链式反应，对高度表达用于诊疗的外源核酸的细胞外囊泡的外源核酸进行定量。
17、在其中一些实施例中，所述细胞外囊泡包括脂质体、人工脂质囊泡、脂质纳米颗粒、植物细胞外囊泡、动物细胞外囊泡、人源细胞来源外囊泡、细菌外膜囊泡、微生物分泌的膜囊泡、细胞膜重组纳米颗粒、细菌外膜重组纳米颗粒、具有包膜结构的病毒颗粒和类病毒颗粒、细胞膜/细菌外膜/病毒膜蛋白杂合的人工纳米囊泡；所述用于诊疗的外源核酸包括质粒、核糖核酸、脱氧核糖核酸、寡核苷酸、环状rna、mirna、mrna、aso、sirna、sarna、sso及eon。
18、本申请目的之二，提供了一种细胞外囊泡，所述的高度表达用于诊疗的外源核酸的细胞外囊泡的快速制备方法制备得到。
19、本申请目的之三，提供了一种药物组合物，包括所述细胞外囊泡。
20、本申请目的之四，提供了一种所述的细胞外囊泡在调控蛋白表达或蛋白替代疗法或免疫诊疗或组织再生中的应用。
21、本申请采用上述技术方案，其有益效果如下：
22、本申请提供的细胞外囊泡、制备方法、药物组合物及应用，对细胞外囊泡产生挤压作用，以使外源核酸载入所述细胞外囊泡中，对装载有所述外源核酸的所述细胞外囊泡进行纯化处理，以获得高度表达的用于诊疗的外源核酸的细胞外囊泡，对高度表达的用于诊疗的外源核酸的细胞外囊泡的外源核酸进行定量，本申请通过高通量的物理挤压方法将具有诊疗性的外源核酸装载到细胞外囊泡中，由于尺寸与细胞外囊泡相近或略小，对细胞外囊泡产生挤压作用，使细胞外囊泡的膜短暂开孔，从而使外源核酸装载其中，保护了核酸的体内稳定性；此外，通过对高度表达的用于诊疗的外源核酸的细胞外囊泡的外源核酸进行定量设计避免繁琐不可控的生物化学过程，定量外源核酸进入靶细胞内并发挥功能以精确调控蛋白表达，提高外源核酸的利用率。
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1.一种细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
2.如权利要求1所述的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，对细胞外囊泡产生挤压作用，以使外源核酸载入所述细胞外囊泡中的步骤中，具体包括下述步骤：
3.如权利要求1或2所述的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，所述细胞外囊泡的尺寸为20nm-2μm，所述外源核酸为序列长度为4-30000的核苷酸。
4.如权利要求3所述的外源核酸的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，所述细胞外囊泡的尺寸为30nm-200nm，所述外源核酸为序列长度为10-50的核苷酸。
5.如权利要求3所述的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，所述外源核酸的浓度为10pM-10μM，所述细胞外囊泡的浓度为1×104-1×1018particle/mL，所述外源核酸与所述细胞外囊泡的体积比为1：50-1:500。
6.如权利要求5所述的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，所述外源核酸的浓度为1nM-1μM，所述外源核酸与所述细胞外囊泡的体积比为1:100-1:200。
7.如权利要求1所述的细胞外囊
8.如权利要求1所述的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，在对高度表达的用于诊疗的外源核酸的细胞外囊泡的外源核酸进行定量的步骤中，具体包括下述步骤：
9.如权利要求1所述的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，所述细胞外囊泡包括脂质体、人工脂质囊泡、脂质纳米颗粒、植物细胞外囊泡、动物细胞外囊泡、人源细胞来源外囊泡、细菌外膜囊泡、微生物分泌的膜囊泡、细胞膜重组纳米颗粒、细菌外膜重组纳米颗粒、具有包膜结构的病毒颗粒和类病毒颗粒、细胞膜/细菌外膜/病毒膜蛋白杂合的人工纳米囊泡；所述用于诊疗的外源核酸包括质粒、核糖核酸、脱氧核糖核酸、寡核苷酸、环状RNA、miRNA、mRNA、ASO、siRNA、saRNA、SSO及EON。
10.一种细胞外囊泡，其特征在于，由权利要求1至8任一项所述的细胞外囊泡的制备方法制备得到。
11.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求8所述的细胞外囊泡。
12.一种如权利要求10所述的细胞外囊泡在调控蛋白表达或蛋白替代疗法或免疫诊疗或组织再生中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
2.如权利要求1所述的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，对细胞外囊泡产生挤压作用，以使外源核酸载入所述细胞外囊泡中的步骤中，具体包括下述步骤：
3.如权利要求1或2所述的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，所述细胞外囊泡的尺寸为20nm-2μm，所述外源核酸为序列长度为4-30000的核苷酸。
4.如权利要求3所述的外源核酸的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，所述细胞外囊泡的尺寸为30nm-200nm，所述外源核酸为序列长度为10-50的核苷酸。
5.如权利要求3所述的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，所述外源核酸的浓度为10pm-10μm，所述细胞外囊泡的浓度为1×104-1×1018particle/ml，所述外源核酸与所述细胞外囊泡的体积比为1：50-1:500。
6.如权利要求5所述的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，所述外源核酸的浓度为1nm-1μm，所述外源核酸与所述细胞外囊泡的体积比为1:100-1:200。
7.如权利要求1所述的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于，在对装载有所述外源核酸的...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨慧，于子桐，张翊，陈思卉，
申请(专利权)人：中科佰乘深圳生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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