【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，具体而言，涉及一种游离dna甲基化特异性位点及dmr区段的检测方法。
技术介绍
1、dna甲基化是一种常见的表观遗传修饰形式，通过在dna分子上添加甲基基团来调节基因表达。dna甲基化是一种常见的表观遗传修饰形式，其在许多生物过程中起着重要的调控作用，包括基因表达、细胞分化和发育等。异常的dna甲基化模式与多种疾病的发生和发展密切相关，尤其是癌症。
2、随着技术的进步，研究人员开始关注血液中的游离dna，通过检测其中的dna甲基化状态，以非侵入性、方便且可重复的方式获得与肿瘤相关的信息。血浆游离dna甲基化检测方法的发展源于对癌症和其他疾病的早期筛查和诊断的需求，在癌症和其他疾病的早期筛查和诊断方面具有巨大的潜力。传统的血浆游离dna检测方法虽然可以检测血浆中的游离dna甲基化的状态，但是也存在着一些弊端。例如，pcr法需要起始量较高的dna样本，检测结果可能会受到样本质量和处理方法的影响，同时也存在着检测结果不稳定、易受污染等问题。此外，pcr法无法检测低浓度的甲基化dna，难以满足一些临床应用的需求。而测序法检测甲基化需要高昂的设备和技术支持，可能存在误差率高、样本处理不易等问题。因此，研究开发一种高效、准确、可靠的甲基化检测方法，对于提高筛查的准确性和效率，降低筛查的成本和风险，具有重要的意义。
技术实现思路
1、本专利技术解决了现有的用于甲基化检测的方法检测灵敏度低的技术问题，实现了提高检测特异度和灵敏度，降低检测成本且操作简便的技术效果
2、为解决上述问题，本专利技术提供一种游离dna甲基化特异性位点及dmr区段的检测方法，包括：s10：提取检测样品的cfdna，采用甲基化修饰依赖型核酸内切酶对cfdna进行酶切，得到酶切产物；s20：将x’y’模板与酶切产物混合，并进行高温变性退火，得到变性退火产物；s30：将包被有y’y’模板序列的流式编码微球与变性退火产物混合，并在ws bst2.0聚合酶、nt.bstnbi切刻内切酶和psti限制性内切酶的作用下进行55℃恒温指数扩增，得到扩增产物；s40：使用流式细胞仪对流式编码微球逐颗进行分析，并检测流式编码微球荧光信号和模板特异性荧光信号。
3、与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本专利技术通过使用甲基化修饰依赖型核酸内切酶对所有含有甲基化位点的序列进行切割，经热变性后，酶切产物可与第一条模板的x’区域互补结合并提供3’-oh活性，以此对甲基化序列与未甲基化的同源序列相区别。通过恒温指数扩增的方式，对能提供3’-oh的序列进行特异性扩增，以此有针对性地增大特异性甲基化序列的含量，使信号放大，产生的特异性y序列会被流式编码微球捕获。经流式细胞仪检测，可快速分析甲基化位点的具体信息以及dmr甲基化率。上述检测步骤操作简便，检测成本低，所需样本少，灵敏度高，特异性强，属于恒温指数扩增信号放大反应，同时缩短检测时长。
4、在本专利技术的一个实例中，甲基化修饰依赖型核酸内切酶为mspji家族成员，包括：mspji，fspei，lpnpi，aspbhi，riai，sgrti中的任意一种或多种。
5、与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本专利技术提供的检测方法使用了mspji家族的甲基化修饰依赖型核酸内切酶，该家族成员可识别近似100％的甲基化位点，进而能够尽可能对所有含有甲基化位点的序列进行切割，提高检测的准确性。
6、在本专利技术的一个实例中，流式编码微球由两种荧光染料按不同浓度配比，形成不同能级的荧光编码微球阵列，每种荧光编码微球的表面连接有一种甲基化位点特异性结合的expar模板序列。
7、与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：每种荧光微球对应一个甲基化位点，即检测靶标，并且不同种类编码微球区分度高，进而能够区分不同甲基化位点，检测特异性高。
8、在本专利技术的一个实例中，每种荧光编码微球的数量为1000至5000颗。
9、与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：由于每种荧光编码微球对应一个甲基化位点，因此，甲基化位点越多，则荧光编码微球的数量越多，便于流式细胞仪对荧光信号的捕获和区分。
10、在本专利技术的一个实例中，恒温指数扩增由两条模板组成，其中，第一条模板为x’y’形式，可与靶序列x特异性结合；第二条模板为y’y’形式，可触发指数扩增，第二条模板的3’端与流式编码微球连接。
11、与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：通过恒温指数扩增(expar)，不需要复杂的仪器设备，可在短时间内表现出很高的放大效率，大大缩短检测时间。第一条模板可与靶序列x特异性结合，在体系中处于游离状态，可触发指数扩增，第二条模板的3’端连接在流式编码微球上，模板带有荧光信号后，可以通过流式细胞仪检测模板特异性荧光信号，检测便捷。
12、在本专利技术的一个实例中，第二条模板的3’端修饰连接基团，连接基团与流式编码微球连接。
13、与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：通过连接基团与流式编码微球连接，操作便捷。
14、在本专利技术的一个实例中，连接基团包括：氨基、生物素中的任一种。
15、与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：第二条模板的3’端修饰氨基或生物素，进而能够与流式编码微球连接。
16、在本专利技术的一个实例中，第二条模板的5’端含有限制性内切酶识别位点，且限制性内切酶识别位点的两侧修饰有荧光基团和猝灭基团。
17、与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：当检测样品中含有目标序列时会触发expar反应，使第二条模板形成双链，被限制性内切酶识别并切割释放猝灭基团产生荧光。荧光基团通过模板序列连接在微球上，在激光激发下会发出强烈的荧光，进而被流式细胞仪捕获。
18、在本专利技术的一个实例中，检测方法还包括：s50：将流式编码微球荧光信号和荧光基团信号转化为定量检测结果，计算位点甲基化信息与dmr区段的甲基化率。
19、与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：由于在不同的肿瘤阶段，dna甲基化位置和甲基化水平存在差异，因此，将核酸双链荧光信号转化为定量检测结果，更为直观，计算得到的位点甲基化信息与dmr区段甲基化率能够起到较好的提示作用。
20、在本专利技术的一个实例中，dmr区段的甲基化率根据检测到的荧光基团的位点数除以dmr区段的所有位点数计算得到。
21、与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：通过上述计算方式，计算得到dmr区段的甲基化率，能够直观反映dna甲基化水平，且计算方便。
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1.一种游离DNA甲基化特异性位点及DMR区段的检测方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述甲基化修饰依赖型核酸内切酶为MspJI家族成员，包括：MspJI，FspEI，LpnPI，AspBHI，RIaI，SgrTI中的任意一种或多种。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流式编码微球由两种荧光染料按不同浓度配比，形成不同能级的荧光编码微球阵列，每种荧光编码微球的表面连接有一种甲基化位点特异性结合的EXPAR模板序列。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，每种所述荧光编码微球的数量为1000至5000颗。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述恒温指数扩增由两条模板组成，其中，第一条模板为X’Y’形式，可与靶序列X特异性结合；第二条模板为Y’Y’形式，可触发指数扩增，所述第二条模板的3’端与所述流式编码微球连接。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述第二条模板的3’端修饰连接基团，所述连接基团与所述流式编码微球连接。
7.根
8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述第二条模板的5’端含有限制性内切酶识别位点，且所述限制性内切酶识别位点的两侧修饰有荧光基团和猝灭基团。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括：
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述DMR区段的甲基化率根据检测到的荧光基团的位点数除以所述DMR区段的所有位点数计算得到。
...【技术特征摘要】
1.一种游离dna甲基化特异性位点及dmr区段的检测方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述甲基化修饰依赖型核酸内切酶为mspji家族成员，包括：mspji，fspei，lpnpi，aspbhi，riai，sgrti中的任意一种或多种。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流式编码微球由两种荧光染料按不同浓度配比，形成不同能级的荧光编码微球阵列，每种荧光编码微球的表面连接有一种甲基化位点特异性结合的expar模板序列。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，每种所述荧光编码微球的数量为1000至5000颗。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述恒温指数扩增由两条模板组成，其中，第一条模板为x’y’形式，可与靶序...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓光，李震，陈小晶，慕燕琼，王子明，
申请(专利权)人：泛肽生物科技浙江有限公司，
类型：发明
国别省市：
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