【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于维生素c乙基醚的合成领域，尤其涉及一种环糊精转移酶突变体基因及其应用。
技术介绍
1、维生素c(vitamin c,vc)，又名l-抗坏血酸，是维持生命不可缺少的水溶性维生素，广泛分布于新鲜水果、蔬菜及植物的绿色部位中。近代研究表明vc在人体内具有促进胶原蛋白的合成，参与芳香氨基酸和脂肪的代谢，改善铁、钙和叶酸的利用，催化黑色素的氧化还原，增强肌体的抗应激能力和免疫力以及抑制癌细胞的增殖等功效。然而人体内缺少古洛糖酸内酯氧化酶而不能合成vc，因此，必须从食物中摄取获得，从而vc被列为人体的必需营养元素。临床上，vc主要用于防治坏血病、增强肌体的抵抗力、促进伤口愈合，并被作为辅助药物用于治疗和保健药品中。此外，在食品领域，vc是重要的酸味剂、抗氧化剂和稳定剂；在化妆品领域，是还原剂、紫外线吸收剂和黑色素合成抑制剂；在畜牧和水产养殖领域，vc具有促进胶原合成、幼龄动物生长，提高幼体成活率，防治黑死病、鱼骨骼异常出血和糜烂等功能。因此，vc广泛应用于医药、动物饲料、化妆品及食品添加剂(27元/公斤)等领域，其中在食品添加剂领域的应用最为主要，约占70％，此外，vc一直是全球最大的原料药之一。
2、然而，vc分子结构中特殊的连烯二醇结构在水溶液和空气中易被氧化降解为脱氢型vc，从而丧失生理活性。20世纪70年代以来，人们就一直致力于研究vc的各类衍生物，期望能找到一种新型vc衍生物，既能克服vc的不稳定性，又能发挥vc的生理学功能。目前，vc的衍生物主要包括vc盐、vc酯和vc糖苷3种形式，其中vc糖苷类衍生物
技术实现思路
1、专利技术目的：本专利技术的第一目的是提供一种环糊精转移酶突变体及其编码基因；本专利技术要解决的另一技术问题在于提供环糊精转移酶突变体在催化维生素c乙基醚化过程中的应用。
2、技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：
3、第一方面，本专利技术提供了一种环糊精转移酶突变体基因，所述基因编码氨基酸序列如seq id no.2所示的环糊精转移酶突变体。
4、作为一种实施方案，所述环糊精转移酶突变体基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
5、第二方面，本专利技术提供了一种环糊精转移酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示。
6、第三方面，本专利技术提供了一种重组表达载体，其包括所述的环糊精转移酶突变体基因。
7、第四方面，本专利技术提供了一种重组微生物，所述微生物包含所述的环糊精转移酶突变体基因，或者表达所述的环糊精转移酶突变体。
8、作为优选，所述微生物为大肠杆菌或毕赤酵母菌。
9、第五方面，本专利技术提供了一种维生素c乙基醚的制备方法，包括以下步骤：以维生素c为底物，以乙醇为乙基醚供体，经所述的环糊精转移酶突变体催化反应形成维生素c乙基醚。
10、作为优选方案，所述环糊精转移酶突变体催化反应的体系为：在1-200mm tris-hcl溶液中，添加有0.1-50mm维生素c、0.1-100μm环糊精转移酶突变体和0.1-50mm乙醇；所述催化反应的温度为10-50℃，反应ph为5-9，反应时间为1-50h。
11、作为具体实施方案，所述维生素c乙基醚的制备方法，包括以下步骤：
12、(1)在表达载体上构建包括所述环糊精转移酶突变体基因、启动子和终止子的环糊精转移酶突变体的表达框，构建环糊精转移酶突变体的重组表达载体；
13、(2)采用宿主细胞转化步骤(1)中的重组表达载体，获得环糊精转移酶突变体的重组菌株，诱导培养，获得环糊精转移酶突变体粗酶液，在体外经酶催化反应获得维生素c乙基醚。
14、作为一种实施方案，步骤(1)中，利用大肠杆菌作为宿主细胞，在大肠表达载体上构建携带有环糊精转移酶突变体基因、t7启动子和t7终止子的表达框，即构建环糊精转移酶突变体的大肠杆菌重组表达框；优选的，所述大肠杆菌表达载体为pet系列载体；
15、进一步优选的，所述表达载体转化大肠杆菌后，挑取阳性克隆子转接到发酵培养基中，于20-37℃条件下进行发酵培养，培养至od600 nm为0.6-0.8，加入终浓度为0.01-1mm的iptg，诱导后离心收集上清。
16、作为另一种实施方案，步骤(1)中，利用毕赤酵母菌作为宿主细胞，在毕赤酵母表达载体上构建携带有环糊精转移酶突变体、aox启动子和aox终止子的表达框，即构建环糊精转移酶突变体的毕赤酵母重组表达框；优选的，所述毕赤酵母表达载体为ppic系列载体。
17、进一步优选的，所述表达载体转化毕赤酵母后，挑取阳性克隆子转接到发酵培养基中，于20-37℃条件下进行发酵培养，培养24h后，加入终浓度为千分之5的甲醇，诱导后离心收集上清。
18、步骤(2)中，所述粗酶液可以进一步再过滤，柱洗脱，收集酶活性部分，浓缩，最后冷冻干燥，之后再进行酶催化反应。
19、第六方面，本专利技术提供了所述的环糊精转移酶突变体基因、所述的环糊精转移酶突变体、所述的重组表达载体、或所述的重组微生物在维生素c乙基醚生物合成中的应用。
20、有益效果：与现有技术相比，本专利技术基因编码的环糊精转移酶突变体是基于环糊精转移酶的晶体结构及底物维生素c和乙醇的化学结构，利用生物信息学软件分子对接、虚拟突变后获得；该突变体与底物维生素c和乙醇具有较高的结合力，其应用于维生素c乙基醚的合成中，提供了生物酶法合成维生素c乙基醚的可能性。
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1.一种环糊精转移酶突变体基因，其特征在于，所述基因编码氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的环糊精转移酶突变体。
2.根据权利要求1所述的环糊精转移酶突变体基因，其特征在于，所述环糊精转移酶突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种环糊精转移酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，包括权利要求1或2所述的环糊精转移酶突变体基因。
5.一种重组微生物，其特征在于，所述微生物包含权利要求1或2所述的环糊精转移酶突变体基因，或者表达权利要求3所述的环糊精转移酶突变体。
6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于，所述微生物为大肠杆菌或毕赤酵母菌。
7.一种维生素C乙基醚的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以维生素C为底物，以乙醇为乙基醚供体，经权利要求3所述的环糊精转移酶突变体催化反应形成维生素C乙基醚。
8.根据权利要求7所述的维生素C乙基醚的制备方法，其特征在于，所述环糊精转移酶突变体催化反应的体系为：
9.根据权利要求7所述的维生素C乙基醚的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.权利要求1或2所述的环糊精转移酶突变体基因、权利要求3所述的环糊精转移酶突变体、权利要求4所述的重组表达载体、或权利要求5或6所述的重组微生物在维生素C乙基醚生物合成中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种环糊精转移酶突变体基因，其特征在于，所述基因编码氨基酸序列如seq idno.2所示的环糊精转移酶突变体。
2.根据权利要求1所述的环糊精转移酶突变体基因，其特征在于，所述环糊精转移酶突变体基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
3.一种环糊精转移酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，包括权利要求1或2所述的环糊精转移酶突变体基因。
5.一种重组微生物，其特征在于，所述微生物包含权利要求1或2所述的环糊精转移酶突变体基因，或者表达权利要求3所述的环糊精转移酶突变体。
6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于，所述微生物为大肠杆菌或毕赤酵母菌。
7.一种维生素c乙基醚的制备...
【专利技术属性】
技术研发人员：查建生，谢光蓉，汪仁，周正雄，李洁，
申请(专利权)人：安徽斯拜科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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