【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，特别涉及一种原核表达制备重组脱氧核糖核酸酶的方法。
技术介绍
1、脱氧核糖核酸酶i(deoxyribonuclease i，dnase i)是一种可水解单链或双链脱氧核糖核酸(dna)的磷酸二酯酶，它识别并切割磷酸二酯键，产生5'端为磷酸基团，3'端为羟基的单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸。dnase i的活性依赖于ca2+，并可被二价金属离子mg2+、mn2+等激活。在mg2+存在的情况下，该酶可随机识别并切割双链dna任意一条链上的任意位点；而在mn2+存在的情况下，可识别并切割dna两条链上几乎相同的位点，产生平末端或有1-2个核苷酸突出的粘末端dna片段。dnase i是分子生物学实验常用的工具酶，用途主要是去除体外转录或者rna纯化时的dna，也可以去除蛋白质中的dna污染，还可以用于医药生产，其最主要的医药应用是降低肺粘性分泌物即痰的粘度，例如在治疗肺炎过程中，由粘性分泌物引起的呼吸道阻塞可能导致呼吸不适，甚至导致窒息死亡，dnase i可以帮助清洁呼吸道。
2、目前已分离纯化出牛、猪、鸡及小鼠dnase i，其中牛源dnase i的商业化应用最为广泛。牛胰腺dnase i(bovine pancreatic deoxyribonuclease i，bp-dnase i)虽然可以直接从牛胰腺中提取，但提纯步骤复杂且受原料限制。因此，采用基因工程技术表达bp-dnase i是高效获得dnase i最便利、最经济的策略，然而其应用也存在很多限制。由于dnase具有降解dna的活性
技术实现思路
1、针对现有技术中原核表达系统表达得到的dnase i的表达量和表达活性低以及对宿主细胞毒性大的问题，本专利技术提供了一种原核表达制备重组脱氧核糖核酸酶的方法。
2、本专利技术具体通过以下技术方案实现：
3、本专利技术的第一方面提供了一种原核表达制备重组脱氧核糖核酸酶的方法，包括以下步骤：
4、s1、将目的基因连接到表达载体的多克隆位点内，构建得到重组表达载体，所述目的基因从上游到下游依次包括xxa标签编码基因和脱氧核糖核酸酶编码基因；
5、s2、将所述重组表达载体导入大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌；
6、s3、培养所述重组大肠杆菌并进行诱导表达，得到重组大肠杆菌培养液；
7、s4、将所述重组大肠杆菌培养液离心后收集菌体，超声破碎所述菌体，离心收集细胞破碎上清液，之后亲和纯化得到脱氧核糖核酸酶融合蛋白。
8、进一步地，所述目的基因还包括纯化标签编码基因，所述纯化标签编码基因位于所述xxa标签编码基因的上游，所述纯化标签选自his标签、myc标签中的至少一种。
9、进一步地，所述目的基因还包括酶切位点编码基因，所述酶切位点编码基因位于所述xxa标签编码基因和所述脱氧核糖核酸酶编码基因之间。
10、进一步地，所述脱氧核糖核酸酶为脱氧核糖核酸酶i，所述纯化标签为6×his标签和myc标签，所述酶切位点为肠激酶酶切位点。
11、更进一步地，所述目的基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
12、进一步地，步骤s1中，将目的基因连接到表达载体的多克隆位点内包括以下步骤：合成所述xxa标签编码基因和所述脱氧核糖核酸酶编码基因，将表达载体pet29a用ndei和ecori限制性内切酶进行双酶切，之后将双酶切后的表达载体pet29a与所述脱氧核糖核酸酶i编码基因和所述xxa标签编码基因混合，进行同源重组。
13、进一步地，步骤s2中，采用热激法将所述重组表达载体导入大肠杆菌中。
14、进一步地，步骤s3中，培养所述重组大肠杆菌并进行诱导表达包括以下步骤：将重组大肠杆菌接种至添加有卡那霉素的液体lb培养基或tb培养基中，培养至od600达到0.6-0.7时，加入终浓度为0.1-1mm的iptg，在37℃诱导表达4-5h。更进一步地，所述iptg的浓度为0.1mm。
15、进一步地，步骤s4中，亲和纯化得到脱氧核糖核酸酶融合蛋白包括以下步骤：将所述细胞破碎上清液上样至平衡好的镍柱中，依次经上样缓冲液和洗脱缓冲液冲洗，收集洗脱液，即获得脱氧核糖核酸酶融合蛋白，其中，上样缓冲液配方包括：20mm tris-hcl、0.5mnacl、5mm咪唑和10％甘油，洗脱缓冲液配方包括：20mm tris-hcl、0.5m nacl、150mm咪唑和10％甘油。
16、本专利技术的第一方面提供了如上所述的原核表达制备重组脱氧核糖核酸酶的方法在制备脱氧核糖核酸酶中的应用。
17、本专利技术的优点及积极效果为：
18、本专利技术通过xxa标签与脱氧核糖核酸酶融合，采用原核表达系统实现了脱氧核糖核酸酶的高效表达，并显著提高了脱氧核糖核酸酶的可溶性表达水平，原核表达得到的脱氧核糖核酸酶融合蛋白具有表达量和纯化得率高、生物活性好和稳定性高等优点，且在诱导表达过程中，大肠杆菌宿主菌活性不受影响，能够持续稳定表达脱氧核糖核酸酶，对于批量化生产脱氧核糖核酸酶具有重要意义。
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1.一种原核表达制备重组脱氧核糖核酸酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的原核表达制备重组脱氧核糖核酸酶的方法，其特征在于，所述目的基因还包括纯化标签编码基因，所述纯化标签编码基因位于所述XXA标签编码基因的上游，所述纯化标签选自His标签、Myc标签中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的原核表达制备重组脱氧核糖核酸酶的方法，其特征在于，所述目的基因还包括酶切位点编码基因，所述酶切位点编码基因位于所述XXA标签编码基因和所述脱氧核糖核酸酶编码基因之间。
4.根据权利要求1所述的原核表达制备重组脱氧核糖核酸酶的方法，其特征在于，所述目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.根据权利要求1所述的原核表达制备重组脱氧核糖核酸酶的方法，其特征在于，步骤S1中，将目的基因连接到表达载体的多克隆位点内包括以下步骤：
6.根据权利要求1所述的原核表达制备重组脱氧核糖核酸酶的方法，其特征在于，步骤S2中，采用热激法将所述重组表达载体导入大肠杆菌中。
7.根据权利要求1所述的原核表达制备
8.根据权利要求7所述的原核表达制备重组脱氧核糖核酸酶的方法，其特征在于，所述IPTG的浓度为0.1mM。
9.根据权利要求1所述的原核表达制备重组脱氧核糖核酸酶的方法，其特征在于，步骤S4中，亲和纯化得到脱氧核糖核酸酶融合蛋白包括以下步骤：
10.如权利要求1-9任一项所述的原核表达制备重组脱氧核糖核酸酶的方法在制备脱氧核糖核酸酶中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种原核表达制备重组脱氧核糖核酸酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的原核表达制备重组脱氧核糖核酸酶的方法，其特征在于，所述目的基因还包括纯化标签编码基因，所述纯化标签编码基因位于所述xxa标签编码基因的上游，所述纯化标签选自his标签、myc标签中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的原核表达制备重组脱氧核糖核酸酶的方法，其特征在于，所述目的基因还包括酶切位点编码基因，所述酶切位点编码基因位于所述xxa标签编码基因和所述脱氧核糖核酸酶编码基因之间。
4.根据权利要求1所述的原核表达制备重组脱氧核糖核酸酶的方法，其特征在于，所述目的基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
5.根据权利要求1所述的原核表达制备重组脱氧核糖核酸酶的方法，其特征在于，步...
【专利技术属性】
技术研发人员：彭刚，聂红艳，蒋烨，石梅香，
申请(专利权)人：尚纯生物科技武汉有限公司，
类型：发明
国别省市：
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