【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生姜土传病害检测，具体属于一种同时快速检测生姜5种土传病害的引物组、试剂盒及应用。
技术介绍
1、生姜(zingiber officinale rosc.)是一种重要的经济作物，广泛分布于亚洲热带和亚热带地区，在我国已有2000多年的种植历史。据2016年联合国粮食及农业组织(fao)数据统计，我国以约54万吨的出口量位居世界第一，约占全世界总出口量的69.89％，这表明我国是世界上最大的生姜生产国、出口国和消费国。然而，随着生姜种植面积和生产规模的不断扩大，由于生姜的生产长期使用无性繁殖技术和连作，生姜产品的质量和产量受到以土传病害为主的多种病害的威胁。青枯雷尔氏菌(ralstonia solanacearum)(后简称青枯菌)的1号和4号生理小种引起的姜青枯病亦叫姜瘟病，是生姜上的一种常见病害，其为害具有潜伏期较长、隐蔽性较强的特点，田间常因诊断不及时而贻误防治时机，难以控制病情扩展。另外，田间有些病害如尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)、轮枝镰刀菌(f.verticillioides)和茄病镰刀菌(f.solani)侵染引起的枯萎病、巴西果胶杆菌(pectobacterium brasiliense)侵染引起的软腐病、阿氏肠杆菌(enterobacterasburiae)和阴沟肠杆菌(e.cloacae)侵染引起的根腐病、瓜果腐霉(pythiumaphanidermatum)、群结腐霉(p.myriotylum)和华丽腐霉(p.splendens)等15种腐霉菌侵染引起的茎腐病都与青枯病的症状
2、随着分子生物学技术的发展，聚合酶链反应技术加速了植物病原的快速检测。然而，一次仅能检测一个dna模板限制了常规pcr的实用性。与之不同的是，在一个反应中结合多对特异性引物的多重pcr能够同时扩增多个dna片段。基于与单一pcr反应相同的原理，多重pcr技术可以高效准确地检测一个反应体系中的多个靶标dna。目前，多重pcr已经被广泛应用于同时对具有多个不同dna或rna靶标的病原菌进行快速检测，具有准确、高效的优点。在多重pcr系统中，为每种目标病原菌设计特异性引物并确保引物之间不会发生交叉反应是研究的关键，而且引物的选择会影响多重pcr检测的特异性和灵敏性。另外，引物扩增片段的大小应存在一定差异，便于区分。其次，引物浓度对多重pcr扩增也很重要，必须保证所有的引物具有相似的扩增效率。
3、青枯雷尔氏菌(ralstonia solanacearum)、镰刀菌(fusarium spp.)、果胶杆菌(pectobacterium spp.)、肠杆菌(enterobacter spp.)和腐霉菌(pythium spp.)分别引起生姜的青枯病(亦称姜瘟病)、枯萎病、软腐病、根腐病和茎腐病，均为土传病害，症状相似，有时存在复合侵染，诊断难度大。本专利技术提供了一种能够同时检测这5种生姜土传病原菌的五重pcr快速检测方法，通过筛选5类病原菌的特异性引物组合，探索体系引物最佳浓度和退火温度，检测体系的灵敏度，建立起最佳的多重pcr反应体系，可对田间植株样品进行检测，灵敏度可到1ng/μl。
4、公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种同时快速检测生姜5种土传病害的引物组、试剂盒及应用，能够快速同时检测青枯菌、镰刀菌、果胶杆菌、肠杆菌和腐霉菌以及田间带菌生姜病株，灵敏度可到1ng/μl，可为生姜土传病害以及同种病原菌引起的其他作物病害的快速诊断提供可靠支持。。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：
3、本专利技术的第一个目的在于提供一种同时快速检测生姜5种土传病害的引物组，包括5对特异性引物：引物对fu3与fu4、引物对rs1f和rs1r、引物对23specf和23specr、引物对en1f和en1r以及引物对py1f和py1r，其序列分别对应如seq id no.1至seq id no.10所示。
4、本专利技术的第二个目的在于提供一种同时快速检测生姜5种土传病害的试剂盒，所述试剂盒包括以下多重pcr反应体系：2×pcr mix 12.5μl、待测病原菌dna模板各1μl、5对特异性引物混合物，加ddh2o补足至25μl；其中，所述5对特异性引物混合物分别为：引物对fu3与fu4、引物对rs1f和rs1r、引物对23specf和23specr、引物对en1f和en1r以及引物对py1f和py1r，其序列分别对应如seq id no.1至seq id no.10所示。
5、更为具体的，所述5对特异性引物混合物具体为：引物对fu3与fu4 1.6μl、引物对rs1f和rs1r 1.2μl、引物对23specf和23specr 0.15μl、引物对en1f和en1r 0.2μl和引物对py1f和py1r 0.6μl。
6、本专利技术的第三个目的在于提供所述同时快速检测生姜5种土传病害的引物组或所述同时快速检测生姜5种土传病害的试剂盒在检测生姜青枯病、枯萎病、软腐病、根腐病和茎腐病中的应用。
7、本专利技术的第四个目的在于提供所述同时快速检测生姜5种土传病害的引物组或所述同时快速检测生姜5种土传病害的试剂盒在检测青枯雷尔氏菌、镰刀菌、果胶杆菌、肠杆菌和腐霉菌中的应用。
8、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
9、本专利技术筛选引起5种生姜土传病害病原菌的特异性引物组，通过不同的引物浓度和退火温度对多重pcr体系进行优化，检测体系的灵敏度，并对土壤和植株样品进行测试，验证其实用性，能够快速同时检测青枯菌、镰刀菌、果胶杆菌、肠杆菌和腐霉菌以及田间带菌生姜病株，灵敏度可到1ng/μl，可为生姜土传病害以及同种病原菌引起的其他作物病害的快速诊断提供可靠支持。
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1.一种同时快速检测生姜5种土传病害的引物组，其特征在于，包括5对特异性引物：引物对Fu3与Fu4、引物对Rs1F和Rs1R、引物对23SPecF和23SPecR、引物对En1F和En1R以及引物对Py1F和Py1R，其序列分别对应如SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示。
2.一种同时快速检测生姜5种土传病害的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下多重PCR反应体系：2×PCR Mix 12.5μL、待测病原菌DNA模板各1μL、5对特异性引物混合物，加ddH2O补足至25μL；其中，所述5对特异性引物混合物分别为：引物对Fu3与Fu4、引物对Rs1F和Rs1R、引物对23SPecF和23SPecR、引物对En1F和En1R以及引物对Py1F和Py1R，其序列分别对应如SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示。
3.根据权利要求2所述的同时快速检测生姜5种土传病害的试剂盒，其特征在于，所述5对特异性引物混合物具体为：引物对Fu3与Fu4 1.6μL、引物对Rs1F和Rs1R 1.2μL、引物对23SPecF和23SPecR 0.
4.根据权利要求1所述同时快速检测生姜5种土传病害的引物组或权利要求2-3任一项所述同时快速检测生姜5种土传病害的试剂盒在检测生姜青枯病、枯萎病、软腐病、根腐病和茎腐病中的应用。
5.根据权利要求1所述同时快速检测生姜5种土传病害的引物组或权利要求2-3任一项所述同时快速检测生姜5种土传病害的试剂盒在检测青枯雷尔氏菌、镰刀菌、果胶杆菌、肠杆菌和腐霉菌中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种同时快速检测生姜5种土传病害的引物组，其特征在于，包括5对特异性引物：引物对fu3与fu4、引物对rs1f和rs1r、引物对23specf和23specr、引物对en1f和en1r以及引物对py1f和py1r，其序列分别对应如seq id no.1至seq id no.10所示。
2.一种同时快速检测生姜5种土传病害的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下多重pcr反应体系：2×pcr mix 12.5μl、待测病原菌dna模板各1μl、5对特异性引物混合物，加ddh2o补足至25μl；其中，所述5对特异性引物混合物分别为：引物对fu3与fu4、引物对rs1f和rs1r、引物对23specf和23specr、引物对en1f和en1r以及引物对py1f和py1r，其序列分别对应如seq id no.1至se...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁高庆，杨维超，周生茂，黄皓，文俊丽，陈振东，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：
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